Geri Dön

Functional characterization of rib-repressing activity of hox pg10 proteins

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  1. Tez No: 780554
  2. Yazar: ÖZLEM AYBÜKE ISIK
  3. Danışmanlar: Belirtilmemiş.
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: Portekizce
  9. Üniversite: Universidade Nova de Lisboa
  10. Enstitü: Yurtdışı Enstitü
  11. Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 197

Özet

Embryonic development is the process by which multicellular organisms build their bodies. Hox genes are among the most relevant regulators of this process. Depending on when and where they are expressed, Hox genes set the segmental identity along the anterior-posterior (A-P) axis of all bilaterian animals. In vertebrate species the axial skeleton is one of the structures requiring patterning input from this family of genes. Hox genes encode for transcription factors characterized by the presence of the homeodomain, a protein motif mediating the binding of the protein to their target DNA. Although most Hox proteins bind rather similar DNA sequences, they typically have very specific functional activities. Relevant to this work is the role of the Hox10 genes in the axial skeleton, which specify lumbar vertebrae as a consequence of their intrinsic rib-blocking activity, a patterning property not shared by any other Hox gene. In most cases, functional specificity of Hox proteins is determined by interaction with particular cofactors, which typically bind parts of the Hox protein outside of their homeodomain. In this study, we identified 4 small linear motifs (C1, C2, C3, C4) in the Nterminal arm of Hox10 proteins, highly conserved both among members of the Hox10 group and throughout evolution. We tested their functional significance by generating Hoxa10 variants containing several deletions and mutations in these small motifs and measured their capability to elicit rib-inhibiting activity in a transgenic assay in mouse embryos. We identified two regions (C1 and C3) that reduced Hoxa10 activity to a certain extent when mutated. Moreover, we showed that these two small motifs are sufficient for conferring rib-inhibiting activity to a Hox protein, as when they were inserted into Hoxb9, which does not have intrinsic rib-blocking properties, the chimeric proteins gained this activity in our transgenic assay. In a vi complementary study, we identified potential protein partners of Hoxa10, using two yeast two-hybrid (Y2H) screens with a E11.5 cDNA library from MatchMaker ClonTech system. One of the screens, made with the whole Hoxa10 protein as a bait, resulted in the identification of Itm2a, Myl6, Arhgap, AdpRH, Plk1, eIF4a and Rnf138 as potential binding partners for Hoxa10. A second screen used the C1 motif of Hoxa10 as bait due to its importance for ribremoval function. In this screen we identified Tle4, Smad4, Cdc20 and Guanine Nucleotide BP as potential interactors of C1. The interaction between Hoxa10 and Smad4 through C1 was further validated in a mammalian system.

Özet (Çeviri)

O desenvolvimento embrionário é o processo através do qual os organismos multicelulares constroem os seus corpos. Os genes Hox estão entre os reguladores mais relevantes deste processo. Dependendo de quando e onde são expressos, os genes Hox estabelecem a identidade segmentar ao longo do eixo A-P de todos os animais bilaterais. Nos vertebrados, o esqueleto axial é uma das estruturas que requer a atividade de padronização desta família de genes. Os genes Hox codificam factores de transcrição caracterizados pela presença de um homeodominio, um motivo proteico que medeia a ligação da proteína ao DNA alvo. Apesar de a maioria das proteínas Hox se ligar a sequências de DNA bastante semelhantes, as suas atividades funcionais são tipicamente muito específicas. Relevante para este trabalho é o papel dos genes Hox10 no esqueleto axial, que especifica as vértebras lombares como consequência da sua atividade intrínseca de bloqueio de formação de costelas, uma propriedade de padronização não compartilhada por qualquer outro gene Hox. Na maioria dos casos, a especificidade funcional das proteínas Hox é determinada pela interação com cofactores específicos, que normalmente se ligam a regiões da proteína Hox fora do seu homeodominio. Neste estudo, identificámos 4 motivos lineares pequenos (C1, C2, C3, C4) no braço N-terminal das proteínas Hox10, altamente conservados tanto entre os membros do grupo Hox10 quanto ao longo da evolução, e testámos o seu significado funcional com um ensaio transgénico em embriões de rato. Através deste processo, gerámos transgenes com variantes Hoxa10 contendo várias deleções e mutações nesses pequenos motivos e medimos a sua capacidade de provocar atividade inibidora de costela. Identificámos duas regiões (C1 e C3) que reduziram a atividade de Hoxa10 até certo ponto quando viii mutadas. Além disso, mostrámos que esses dois pequenos motivos são suficientes para conferir atividade inibidora de costela a uma proteína Hox, uma vez que quando inseridos em Hoxb9, que não possui atividade intrínseca de bloqueio de costela, as proteínas quiméricas ganharam essa atividade no nosso ensaio transgénico. Num estudo complementar, identificámos potenciais parceiros proteicos da proteína Hoxa10, usando dois rastreios pelo Método Dois-Híbrido de Levedura (Y2H) de uma biblioteca de cDNA embriões de ratinho de 11.5 de idade embrionária no sistema MatchMaker ClonTech. Um dos rastreios, feito com a proteína Hoxa10 inteira como isco, resultou na identificação das proteínas Itm2a, Myl6, Arhgap, AdpRH, Plk1, eIF4a e Rnf138 como possíveis parceiros de ligação para Hoxa10. Um segundo rastreio usou o motivo C1 da proteína Hoxa10 como isco devido à sua importância para a função de inibição de costela. Neste rastreio, identificámos Tle4, Smad4, Cdc20 e Guanine Nucleotide BP como potenciais parceiros de interação de C1. A interação entre Hoxa10 e Smad4 através de C1 foi ainda validada num sistema em mamíferos.

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