The synthesis, SLIC based labeling, and characterization of microbial rhodopsins by using custom build spectroscopic methods
Mikrobiyal rodopsin membran proteinlerin sentezi, SLIC yöntemiyle etiketlenmesi, ve spektroskopik yöntemlerle karazterizasyonu
- Tez No: 783901
- Danışmanlar: DOÇ. DR. HALİL BAYRAKTAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Genetik, Biology, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Tip I opsinler, mikrobiyal opsinler olarak da bilinen yedi transmembran sarmala ve retinale sahip integral membran proteinleridir. Mikrobiyal opsinler genellikle molekülün rodopsin formu ile bilinir. Rodopsin geniş anlamda opsin ve kromoforun birlikte bulunduğu formu ifade etmek için kullanır. Mikrobiyal opsinlerin birçoğu iyon kanalları veya iyon pompalardır ve bir G proteinine veya kompleksine bağlanmazlar. Tip I opsinler yaşamın her üç domeninde de bulunur. Mikroorganizmalarda, ışık sensörleri (duyusal rodopsinler), transmembran klorür pompaları (halorhodopsinler) ve enerji tasarruflu transmembran proton pompaları (bakteriorhodopsin veya proteorhodopsin) dahil olmak üzere çok sayıda homolog rodopsin formu tanımlanmıştır. Rodopsin proteinleri optogenetik alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin membran voltaj seviyesinin belirlenmesinde kullanılır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda rodopsin proteinlerinin farklı biyoteknolojik uygulamaları gösterilmiştir. Rodopsinlerin ışıkla membran potansiyelini kontrol etmek için araçlar olarak kullanımları, optogenetiğin dönüştürücü teknolojisi için temeldir. Membran voltajı tüm hücrelerde bulunur ve elektrik sinyali oluşturarak, yüklerin taşınmasını ve hücreler arasında iletişimin sağlanmasında görev alır. Voltaj değişimini hücrelerde absorpsiyon değişimine bağlı yöntemler ile ölçmek verimli olmadığı için daha hassas olan floresan yöntemlere ihtiyaç vardır. Voltaj sinyallerinin rodopsin aracılı biyosensörler ile görüntülenmesine yönelik literatürde önemli çalışmalar bulunmaktadır. Mevcut biyosensörler kısa dalga boyunda çalıştıkları için ve dinamik değerleri düşük olduğu için in-vitro ve in-vivo deneylerinde istenilen sonucu vermemektedir. Mikrobiyal rodopsin proteinlerinin dinamiklerinin anlaşılması, rodopsinlerin fotofiziksel özelliklerini ayarlamak için önemlidir. Bunları floresan proteinlerle etiketlemek ve lokalizasyonlarını ayrıntılı olarak karakterize etmek de gereklidir. Elektrokromik floresan enerji transferi için öncelikli olarak uygun floresan protein belirlenmelidir. Floresan proteininin (FP) emisyon sinyali ile membran proteininin absorbsiyon sinyalinin örtüşmesi gereklidir. Örtüşme miktarı hesaplanarak en uygun floresan proteinler seçildikten sonra membran ve floresan proteini birbirine bağlayan peptidin yapısı belirlenmelidir. Seçilen peptidin hem uzunluğu hem de bükülme oranı önemli olduğundan farklı yapıların test edilerek optimizasyon yapılması gerekmektedir. Uzunluğa ek olarak bağlantı yapısının elastik formu da sinyali etkileyen bir diğer unsurdur. Peptid yapılar hareketli ve katı yapılar olarak iki başlık altında toplanabilir. Yapıda yer alan amino asitlerin peptid esnekliğini değiştirdiği ve enerji transferini doğrudan etkilediği bilinmektedir. Buna ek olarak proteinlerin sentezi ve de biyolojik aktivite üzerinde olumsuz olarak etkili olduğu gösterilmiştir. Rodopsin protein dinamiklerinin hücrelerde belirlenmesi amacıyla floresan proteinler ile işaretlenmesi oldukça iyi bir stratejidir. Elde edilen protein yapılar rodosin dinamiklerinin farklı hücrelerde belirlenmesi için kullanılabilir. Farklı floresan yapılar test edilerek uygun floresan proteinlerin seçilmesi gereklidir. Eğer bu örtüşme iyi değilse floresan sinyalinin etkinliği çok az olur. Sinyal miktarı örtüşme miktarı ile doğrudan ilişkilidir. Zaman bağlı olarak bu örtüşmede bir değişim olursa bu gerçek zamanlı floresan mikroskopisi ile gözlemlenebilir. Bu yöntem fotokromik floresan rezonans enerji transferi (pcFRET) olarak bilinir. Burada en önemli nokta Förster çapının alıcı moleküldeki spektrasının değişmesine bağlı olarak değişmesi olayıdır. Alıcı molekülün uyarılma spektrası ile verici molekülün emisyonu arasındaki spektrumun zamanla ne kadar örtüştüğü önemlidir. İki molekül arasındaki mesafenin 10 nm'nin altında olması koşulu bulunmaktadır. Bu mesafenin üzerinde ne normal floresan enerji transferi ne de fotokromik enerji transferi mümkün değildir. Fotokromik veya elektrokromik enerji transferinde uyarılma özelliği değişen herhangi bir molekül ile verici floresan moleklü bir araya getirildiğinde bu uyarılma farkına göre verici molekülün floresan sinyalinde değişiklikler olur. Fotokromik enerji transferi (pcFRET) genel olarak absorbsiyon spektrumundaki değişiklikleri floresan sinyale çevirir. pcFRET metodu kullanılarak membran protein dinamiklerinin genetik olarak kodlanan biyosensörler aracılığı ile gerçek zamanlı ölçülebildiği literatürdeki çalışmalarda gösterilmiştir. Bu çalışma kapsamında farklı floresan proteinler sekans ve ligasyon bağımsız bir metod olan SLIC klonlama yöntemi kullanılarak SRII geninin C terminaline klonlanmıştır. Farklı yapıların test edilmesi amacıyla mCerulean, EGFP, tdTomato ve mScarlet floresan proteinleri kullanılmıştır. Işıkla uyarılınca SRII fotodöngüsündeki O hal durumu için tdTomato ve Scarlet ve başlangıç durumu içinde GFP ve Cerulean floresan proteinleri seçilmiştir. SLIC ile oluşturulan SRII-FP yapıları klonlama sonrasında floresan proteine özgü primerler kullanılarak koloni PCR metodu ile test edilmiştir. Buna ek olarak SLIC metodu sekanslama ile doğrulanmıştır. Burada standart klonlama tekniklerinden farklı olarak SLIC metodu ile oluşturulan füzyon proteinler BL21 hücrelerinde eksprese edildi. Bu yapılara ek olarak duyusal rodopsin (SRII) ve mavi proteorodopsin (BPR) absorpsiyon spektroskopisi kullanılarak benzer şekilde karakterize edildi. Çalışma kapsamında rhodopsin'i moleküler biyoloji ve çeşitli spektroskopi yöntemleri kullanarak sentezledik, saflaştırıldı ve incelendi. Rhodopsin BL21 hücrelerinde sentezlendikten sonra his-tag afinite kolon kromatografisi ile saflaştırıldı ve n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside olarak bilinen deterjan solüsyonu ile sulandırıldı. Rodopsin'in pH'ın bir fonksiyonu olarak renk ayarı absorpsiyon spektroskopisi kullanılarak araştırıldı. BPR'nin asidik koşullar altında büyük bir kırmızıya kayma geçirdiğini bulduk. pH değeri arttıkça bazik çözeltide turuncudan kırmızıya dönen bir renk elde edildi. Rodopsin merkezindeki retinalin depronasyonunun BPR'nin renginde önemli bir değişikliğe yol açtığı sonucuna vardık. Ayrıca, iki lazer çizgisi ve op amp ışık detektörü ile donatılmış özel yapım bir spektrometre kullanarak BPR'nin geçici absorpsiyon değişikliklerini ölçtük. Lazerler ile veri toplama ve kontrolü labview ile programlanan programlabilir rio cihazı ile arduino kullanılarak yapılmıştır. Sonuçlarımız, BPR'nin 532 nm diyot lazer ile uyarıldıktan sonra bir emilim değişikliğine uğradığını göstermektedir. Sonuç olarak BPR, azalan pH üzerine deprotonasyon nedeniyle büyük bir spektral kaymaya maruz kalır ve proteinin rengini değiştirir. SLIC yöntemi, floresan etiketli rodopsin proteinlerini hazırlamak için uygun maliyetli bir yöntem sağlanmıştır. Moleküler biyolojide kullanılan standart klonlama tekniklerinin aksine zaman ve maliyet açısından elverişli olan SLIC metodu üzerinde çalışılmış, yöntem bu çalışmamızda optimize edilmiştir ve diğer moleküler klonlama tekniklerine alternatif olarak kullanılabilecektir. Özel yapım pompa-sonda spektroskopi sistemi hazırlanmış, gelecekteki çalışmalarda floresan etiketli rodopsin proteinlerinin karakterizasyonu için de kullanılabilir duruma getirilmiştir.
Özet (Çeviri)
Type I opsins (also known as microbial opsins) are seven transmembrane-domain proteins with retinal chromophore absorbing incoming light. Most of them are ion channels or pumps although they do not directly bind to G protein complexes. They are found in all three domains of life. Numerous homologous forms of rhodopsins have been identified in the microorganisms, including light sensors (sensory rhodopsins), transmembrane chloride pumps (halorhodopsins), and energy saving transmembrane proton pumps (bacteriorhodopsin or proteorhodopsin). Rhodopsin proteins are widely used in the field of biotechnology. For example, it is used to determine the membrane voltage level in neurons. The use of rhodopsins as tools to control membrane potential with light is another technique for transformative optogenetics technology. Membrane voltage is present in all cells, and it creates an electric signal to carry the signal across the cell membrane and provides cell-cell communication. Since the absorption methods are not sufficient to measure voltage signal due to low signal to noise ratio in cells, more sensitive fluorescent methods based on rhodopsin are strongly preferred for a wide spectrum of applications. An understanding of the dynamics of the microbial rhodopsin proteins is essential to tune the photophysical properties of rhodopsins. It is also necessary to label them with fluorescent proteins and characterize their localization in detail. For the fluorescent signal to vary with the amount of light absorption in the membrane protein, the linker peptide between the proteins has to be optimized for various applications. For electrochromic fluorescent energy transfer, it is necessary to select the appropriate fluorescent protein. The emission signal of the fluorescent protein must overlap with the absorption signal of the membrane protein. After the most suitable fluorescent proteins are selected by calculating the amount of overlap, the structure of the peptide that binds the membrane and the fluorescent protein should be determined. Since both the length and the bending ratio of the selected peptide are important, it is necessary to optimize by testing different constructs. Here we have synthesized, purified, and studied the rhodopsin by using molecular biology and various spectroscopy methods. After the synthesis of rhodospins in BL21 cells, it was purified with his-tag affinity column chromatography and reconstituted with a detergent solution. The color tuning of rhodopsin as a function of pH was investigated by using absorption spectroscopy. We found that BPR undergoes a large red shift under acidic conditions. A pH value was increased the color turned from orange to red at the basic solution. We concluded that the deprotonation of the retinal at the rhodopsin center results in a significant change in the color of BPR. We have also measured the transient absorption changes of BPR by using a custom home built spectrometer that was equipped with two laser lines and an op amp light detector. The data acquisition and the control of lasers were performed an by arduino and field programmable gate array device programmed with arduino and labview respectively. Our results indicate that BPR underwent an absorption change after stimulated with a 532 nm diode laser. Finally, the fluorescent proteins were also cloned into the SRII gene by using SLIC cloning method and expressed in BL21 cells to determine the changes in fluorescent emission. Sensory rhodopsin was similarly characterized by using absorption spectroscopy. As conclusion, BPR undergoes a large spectral shift due to deprotonation upon decreasing pH and alters the color of the protein. SLIC method provides a cost-efficient method to prepare fluorescently labeled rhodopsin proteins. Contrary to the standard cloning techniques used in molecular biology, the SLIC method, which is convenient in terms of time and cost, has been studied and the method has been optimized. The optimized SLIC method can be used as an alternative to other molecular cloning techniques. The custom build pump-probe system can also be used for the characterization of fluorescently labeled other rhodopsin proteins in future studies.
Benzer Tezler
- Yeni tetrapirol türevlerinin sentezi
The synthesis of new tetrapyrrol derivatives
BEHİCE ŞEBNEM SUNGUR
- Suda çözümlenebilen akrilamid-CO-1-vinil-2-pirolidon kopolimerlerinin sentezi ve flokulasyon özelliklerinin incelenmesi
The Synthesis and investigation floculation properties of acrylamide-CO-1-vinly-2-pyrrolidon copolymers water soluble
ABDULLAH AYGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Eğitim ve ÖğretimKaradeniz Teknik ÜniversitesiFen Bilimleri Eğitimi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. İSMAİL ÇAKMAK
- Yeni bir tetraoksim ligandının dinükleer, tetranükleer geçiş metal komplekslerinin sentezi ve karakterizasyonu
The Synthesis and characterization of a novel tetraoxime and its nuclaer and tetranuclear transition metal complexes
KERİM SERBEST
- Bazı glisidil eterlerin mikroorganizmalar kullanılarak sentezlenmesi ve bunların beta-adrenerjik reseptör blokörlerine dönüştürülmesi
The Synthesis of some glycidyl ethers using microorganisms and their conversion into beta-adrenergic receptor blockers
TAYFUN OLTULU
- Fosfor içeren makrosiklik lariat eterlerin sentezi ve kompleksleri
The Synthesis of macrocyclic lariat ethers containing phosphorusand their complexes
SELEN BİLGE