Fındık (Corylus avellana L.) hücre kültürlerinde metabolizma mühendisliği yaklaşımı ile taksan biyosentezinin uyarılması
Induction of taxane biosynthesis in hazelnut (Corylus avellana L.) cell cultures through metabolism engineering approach
- Tez No: 804337
- Danışmanlar: PROF. DR. ŞULE ARI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Genetik, Biology, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 92
Özet
Paklitaksel akciğer, yumurtalık ve meme kanserinin yanı sıra Kaposi sarkomunun tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir diterpenoiddir. Fındık (Corylus avellana L.) hücre süspansiyon kültürleri, paklitakselin yanı sıra 10-deasetil bakkatin III, bakkatin III ve sefalomannin gibi önemli taksanların üretimi için uygun sistemlerdir. Bununla birlikte, C. avellana hücre süspansiyon kültürlerinde üretiminin taksanların artırılması için çeşitli elisitörlerin kullanılması gerekmiştir. Bu tez çalışması kapsamında taksan üretimini artırmaya yönelik elisitasyon uygulaması için antikanser taksanları içeren bir Türk fındık çeşidi olan Corylus avellana cv. Kalınkara'da aktif bölünen kalluslar elde edilmiş ve bu kalluslardan hücre süspansiyon kültürleri kurulmuştur. Altı aylık homojenize hücre süspansiyon kültürlerine, logaritmik evrenin ortasına karşılık gelen kültürlemenin 17. gününde yapılan 1 µM koronatin elisitörü, 3 µM fenilalanin öncülü ve 50 mM metil-β-siklodekstrin nano-taşıyıcısının ayrı ayrı ve kombinasyon halindeki uygulamaların etkileri kültürlerin üreme özellikleri (biyokütle birikimi ve hücre canlılığı) ile taksan metabolitlerinin üretimi arasındaki ilişkinin anlaşılması için incelenmiştir. C. avellana Kalınkara hücre süspansiyon kültürlerinde koronatin, fenilalanin ve koronatin + fenilalanin uygulamaları kültürlerin üreme özelliklerini (yaş ağırlık, kuru ağırlık, hücre sayısı) ve hücre canlılığını negatif etkilemiş, metil-β-siklodekstrinin ise biyokütle birikimini ise artırmıştır. Metil-β-siklodekstrinin diğer elisitörlerle birlikte uygulanması (koronatin + metil-β-siklodekstrin, fenilalanin + metil-β-siklodekstrin ve koronatin + fenilalanin + metil-β-siklodekstrin) ise elisitörlerin hücre süspansiyon kültürlerinin biyokütle birikimine ve hücre canlılığına verdikleri zararı nispeten azaltmıştır. Elisitasyon uygulanmamış kontrol hücre süspansiyon kültürlerinde hücre içinde 10-deasetil bakkatin III 0,878 µg/g, bakkatin III 36,424 µg/g, sefalomannin 0,519 µg/g, paklitaksel 16,812 µg/g üretilmiştir. Hücre süspansiyon kültürlerine 1 µM koronatin eklendiğinde ise hücre içinde üretilen 10-deasetil bakkatin III (0,648 µg/g) ve bakkatin III (3,126 µg/g) miktarı azalırken, sefalomannin (1,747 µg/g) ve paklitaksel (32,00 µg/g) kontrole göre sırasıyla 3,36 ve 1,90 kat artmıştır. Koronatin + fenilalanin ilave edilmiş hücre süspansiyon kültürlerinde ise kontrole göre 10-deasetil bakkatin III, bakkatin III, sefalomannin ve paklitaksel arasından sadece paklitaksel üretimi (17,34 µg/g) artmıştır. Diğer uygulamalar (koronatin + metil-β-siklodekstrin, fenilalanin + metil-β-siklodekstrin ve koronatin + fenilalanin + metil-β-siklodekstrin) taksan üretiminin artırılmasında etkili olmamıştır. Paklitakselin hücre dışına en fazla salgılandığı (3,793 µg/g) koşul ise 50 mM metil-β-siklodekstrin uygulamasıdır. Koronatinin fenilalanin ve metil-β-siklodekstrin ile ikili uygulandığı kültürlerde hücre dışına salgılanan taksan miktarında önemli biçimde artışlar gözlenmiştir. 1 µM koronatin + 3 µM fenilalanin ve 1 µM koronatin + 50 mM metil-β-siklodekstrin eklenmiş hücre süspansiyon kültürlerinde hücre dışı 10-deasetil bakkatin III miktarı (0,796 µg/g ve 0,753 µg/g) kontrol ile benzerken, bakkatin miktarı ise 4,63 (2,109 µg/g) ve 3,26 (1,482 µg/g) kat artmıştır. Bu iki kültürdeki hücre dışına salgılanan sefalomannin miktarı ise, 1 µM koronatin uygulamasına göre, sırasıyla yaklaşık olarak 5,5 (3,656 µg/g) ve 10 (6,016 µg/g) kat artmıştır. Ayrıca bu kültürlerde hücre dışına sırasıyla 1,569 µg/g ve 2,771 µg/g paklitakselin de salgılandığı gösterilmiştir. Kontrol kültürlerde hücre içinde üretilen taksan miktarı, total taksan (hücre içi + hücre dışı) miktarının %97,77'si iken, 1 µM koronatin, 3 µM fenilalanin ve 50 mM metil-β-siklodekstrinin ayrı ayrı eklendiği kültürlerde total taksan miktarlarının hücre içi taksanlara oranları sırasıyla %91,74, %83,545 ve %74,95 olarak bulunmuştur. Bu elisitasyon uygulamaları ile hücre dışına salgılanma oranları ise sırasıyla %8,25, %16,455 ve %25,04'tür. Elisitörler birlikte uygulandıklarında ise hücre dışına salgılanma oranları (koronatin + fenilalanin için %25,15, koronatin + metil-β-siklodekstrin için %36,48, fenilalanin + metil-β-siklodekstrin için %41,85, koronatin + fenilalanin + metil-β-siklodekstrin için %40,22) artmıştır. Bu çalışmanın sonucunda, koronatin elisitörü ile hücre içinde üretilen paklitaksel miktarı artırılırken, metil-β-siklodekstrinin varlığında elisitörlerin hücre biyokütlesine ve hücre canlılığına olan toksik etkileri azaltılmıştır. Ayrıca koronatin + metil-β-siklodekstrin, fenilalanin + metil-β-siklodekstrin ve koronatin + fenilalanin + metil-β-siklodekstrin eklenmiş hücre süspansiyon kültürlerinde taksanların hücre dışına salgılanmasında sinerjistik bir etki görülmüştür. Bu çalışma ile fındık hücre süspansiyon kültürlerinde hem biyokütle hem de antikanser taksanların üretiminin artırılmasına yönelik elisitasyon koşulları ilk kez belirlenmiştir. Elde edilen sonuçların fındıkta biyoteknolojik yolla taksan üretimi çalışmalarına temel oluşturabileceği düşünülmüştür.
Özet (Çeviri)
Paclitaxel is a diterpenoid that is broadly used for the treatment of lung, ovarian and breast cancer as well as Kaposi's sarcoma. Hazelnut (Corylus avellana L.) cell suspension cultures represent feasible systems for the production of the invaluable taxanes including 10-deacetyl baccatin, baccatin III, cephalomannine alongside of paclitaxel. However the limited-scale production of taxanes in C. avellana cell suspension cultures has necessitated the use of several elicitors. In this thesis study, active dividing callus cultures were obtained from a Turkish hazelnut variety, Corylus avellana cv. Kalınkara containing anti-cancer taxanes, for elicitation treatment aimed at increasing taxane production. Later, cell suspension cultures were established from the callus. The effects of separate and combined treatments of 1 µM coronatine elicitor, 3 µM phenylalanine precursor, and 50 mM methyl-β-cyclodextrin nano-carrier on the growth characteristics (biomass accumulation and cell viability) of the cultures and the production of taxane metabolites were investigated to understand the relationship between them. These treatments were performed on the 17th day of culturing, corresponding to the middle of the logarithmic phase. The treatments of coronatine, phenylalanine, and coronatine + phenylalanine negatively affected the growth characteristics (fresh weight, dry weight, cell count) and cell viability of hazelnut (C. avellana cv. Kalınkara) cell suspension cultures. However, the treatment of methyl-β-cyclodextrin increased the biomass accumulation of C. avellana cell suspension cultures. Furthermore, when methyl-β-cyclodextrin was applied together with other elicitors (coronatine + phenylalanine, phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin, coronatine + phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin), it relatively eliminated the damage caused by elicitors to the biomass accumulation and the cell viability of the cell suspension cultures. In the control cell suspension cultures without elicitation, 10-deacetyl baccatin III (0,878 µg/g), baccatin III (36,424 µg/g), cephalomannine (0,519 µg/g), and paclitaxel (16,812 µg/g) were produced inside the cells. When 1 µM coronatine was added to the cell suspension cultures, the amounts of 10-deacetyl baccatin III (0,648 µg/g) and baccatin III (3,126 µg/g) produced inside the cells decreased, while the amounts of cephalomannine (1,747 µg/g) and paclitaxel (32,00 µg/g) increased by 3,36 and 1,9 fold, respectively, compared to the control. In the cell suspension cultures with the addition of both coronatine and phenylalanine, only the production of paclitaxel (17,34 µg/g) increased, among 10-deacetyl baccatin III, baccatin III, cephalomannine and paclitaxel, compared to the control. Other treatments (coronatine + methyl-β-cyclodextrin, phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin, coronatine + phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin) did not effectively increase taxane production. The condition where paclitaxel was secreted the most outside the cell (3,793 µg/g) was the treatment of 50 mM methyl-β-cyclodextrin. Dramatic enhancement in the amount of secreted taxanes outside the cell was observed when coronatine was applied in combination with phenylalanine and methyl-β-cyclodextrin. In cell suspension cultures which coronatine + phenylalanine and coronatine + methyl-β-cyclodextrin were added, the amounts of 10-deacetylbaccatin III secreted outside the cell (0,796 µg/g and 0,753 µg/g) was similar to the control, while the amount of baccatin III increased by 4,63 (2,109 µg/g) and 3,26 (1,482 µg/g) fold, respectively, compared to the 1 µM coronatine treatment. Additionally, it was shown that 1,569 µg/g and 2,771 µg/g of paclitaxel were secreted outside the cell in these cultures, respectively. In the control cell suspension cultures, the amount of taxanes produced inside the cells was observed to be 97,77% of the total taxane (cell-associated + extracellular) amount. In cell suspension cultures treated with 1 µM coronatine, 3 µM phenylalanine, and 50 mM methyl-β-cyclodextrin separately, the ratios of the total taxane amount to the intracellular taxane amount were 91,74%, 83,545%, and 74,95%, respectively. The ratios of secretion outside the cell with these elicitation treatments were 8,25%, 16,455%, and 25,04%, respectively. When the elicitors were applied together (coronatine + phenylalanine, coronatine + methyl-β-cyclodextrin, phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin, coronatine + phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin), the ratios of secretion outside the cell (25,15%, 36,48%, 41,85%, %40,22) increased even more. As a result of this study, while the amount of paclitaxel produced inside the cells was increased by the coronatine elicitor, the toxic effects of the elicitors on cell biomass and cell viability were reduced in the presence of methyl-β-cyclodextrin. Furthermore, a synergistic effect was observed in the secretion of taxanes outside the cells in cell suspension cultures treated with coronatine + methyl-β-cyclodextrin, phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin, and coronatine + phenylalanine + methyl-β-cyclodextrin. This study aimed to determine the elicitation conditions for increasing both biomass and anti-cancer taxane production in hazelnut cell suspension cultures for the first time. The results obtained may provide a basis for biotechnological taxane production studies in hazelnut
Benzer Tezler
- Antikanser taksanların fındık (Corylus avellana) hücre kültürlerinde biyoteknolojik üretimi
Biotechnologically production of anticancer taxanes in hazelnut (Corylus avellana) cell cultures
İLAYDA GÖKTEPE
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞULE ARI
- Türkiye'de yetişen fındık (Corylus avellana L.) çeşitlerinde antikanser taksanların analizi
Analysis of anticancer taxanes in hazelnuts (Corylus avellana L.) grown in Turkey
GÜLBAHAR ZEHRA KUTLUTÜRK
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞULE ARI
- Sakarya ilinde yetiştirilen fındıklarda fındık kurdu (Curculio nucum L.) (Col.: Curculıonıdae) ve fındık kokarcası (Palomena prasına L.) (hem.: pentatomıdae) popülasyonlarının gelişimi ve zararlarının belirlenmesi
Determination of population development and damage status of the nut weevil (Curculio nucum L.) (Col .: Curculionidae) and the green shield bug (Palomena prasina L.) (Hemiptera: Pentatomidae) in Sakarya province
SEMRA ATEŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
ZiraatBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GÜLAY KAÇAR
- Karadeniz bölgesinde yetiştirilen fındıkların yağ asitleri kompozisyonunun araştırılması
Investigating the fatty acid composition of hazelnuts produced at the Black Sea region
FİKRET TÜFEKCİ
Doktora
Türkçe
2018
Gıda Mühendisliğiİstanbul Aydın ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞÜKRÜ KARATAŞ
- Sakarya ilinde fındık bahçelerinde külleme hastalığının mücadelesi
Management of powdery mildew disease in hazelnut orchards in Sakarya province
ŞEHRİBAN ÇELİK TUĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
ZiraatTekirdağ Namık Kemal ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ARZU COŞKUNTUNA