The role of deubiquitinating enzyme USP22 in human somatic cell reprogramming
İnsan somatik hücre yeniden programlamasinda deubiquitinating enzim USP22'nin rolü
- Tez No: 805766
- Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Moleküler Tıp, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 84
Özet
OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC (OSKM) anlatımıyla insan somatik hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPKH) yeniden programlanabilir. Yeniden programlamaya engel hücre içi mekanizmalar mevcuttur. Kromatin yolaklarından yeniden programlamaya engel olacakları bulmak için CRISPR-Cas9 ile susturma taraması yaptık. DNMT3A ve EP300 gibi yeniden programlamaya bariyer olduğu bilinen genlerin dışında bu tarama USP22 için de bariyer rol belirlemiştir. Bu tezde fonksiyon kaybı yöntemiyle USP22'nin bariyer rolü teyit edilmiştir. Bunun üstüne, USP22'nin farklı mutantlarının anlatımıyla, USP22'nin katalitik aktivitesinin ve SAGA kompleksine katılımının yeniden programlama üzerinde bir etkisi olmadığı ortaya çıkmıştır. İlgi çekici olarak, ATXN7L3 ve ENY2 gibi SAGA DUB modülüne ait genler CRISPR-Cas9 metoduyla susturulduğunda, yeniden programlama verimi üzerinde herhangi bir olumlu etkisi görülmemiştir. USP22'nin insan pluripotensisi üzerindeki etkisini araştırmak için USP22 geni susturulmuş tek hücreden büyüyen klonlar elde edilmiştir. Bu klonlar tıpkı kontrol klonları gibi pluripotensi belirteçlerinin anlatımını sağlamış, teratom oluştururken üç embriyonik tabakadan dokulara farklılaşabilmiş ve normal karyotip göstermişlerdir. Belirli tabakalara farklılaşmadaki hataları anlamak için bu klonlar in vitro farklılaşmaya maruz bırakılmışlardır. OCT4 ve SOX2 gibi pluripotensi belirteçlerinin basarisiz bir şekilde düşmesiyle, plurpotensiden çıkışta problemler saptanmıştır. Dahası, mezoderm ve endoderm farklılaşmada USP22 susturulmuş klonlarda belirteçlerin daha düşük anlatımı olduğu için problemler saptanmıştır. USP22'nin susturulmasıyla artan yeniden programlama verimi hakkında daha mekanistik bilgi kazanmak için RNA-dizileme yapılmıştır. USP22 geni susturulmuş ve kontrol fibroblastlar OSKM anlatımıyla yeniden programlanmış ve 6. günde RNA-dizileme yapılmıştır. Beklendiği üzere, gelişim ile ilgili gen setleri USP22'nin silinmesiyle negatife korele olurken pluripotensi ile ilgili gen setleri pozitif korele olmuştur. SOX2 hedef genleri pozitif korele olan gen setlerinden biriydi ve biz USP22'nin silinmesiyle endojen pluripotensi ağı yeniden programlamada daha erken aktive olarak verimi arttırmaktadır diye hipotez geliştirdik. Bu hipotezi test etmek için yeniden programlamanın farklı günlerinde RNA toplanarak endojen SOX2 seviyesinin kontrole göre 3 kata kadar arttığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar USP22'nin endojen plurpotensi ağını katalitik aktivitesi ve SAGA'dan bağımsız olarak baskılayarak yeniden programlamaya engel olduğunu göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Human somatic cells can be reprogrammed to induced pluripotent stem cells (iPSC) by overexpressing OCT4, SOX2, KLF4 and MYC (OSKM). There are cell intrinsic barriers to reprogramming. We conducted a CRISPR-Cas9-mediated knockout screen during reprogramming to reveal chromatin pathways acting as barriers to reprogramming. Other than DNMT3A and EP300 which were already known to be barriers to reprogramming, this screen revealed a barrier role for USP22 during reprogramming. In this thesis, I validated the barrier role of USP22 in reprogramming by loss-of-function assay. In addition to this, overexpression of various USP22 mutants revealed that USP22 deubiquitinase activity or its integration into the SAGA complex does not affect reprogramming. Interestingly, CRISPR-Cas9-mediated knockout of SAGA deubiquitinase members, ATXN7L3 and ENY2 had no positive impact on reprogramming efficiency. To investigate the effect of USP22 on human pluripotency, I obtained single USP22 knockout clones. These clones expressed pluripotency markers, contributed to tissues from three germ layers when subjected to teratoma formation assay and showed normal karyotyping as in control pluripotent stem cells. To understand the defects in specific lineage specifications, these clones were subjected to in vitro embryoid body formation assay. There seem problems in pluripotency exit as revealed by unsuccessful downregulation of pluripotency markers such as OCT4 and SOX2. Furthermore, mesoderm and endoderm differentiation defects were observed in one of USP22 knockout clones compared to wild-type clones as judged by the lower expression levels of marker genes. To gain more mechanistic insight on the USP22 loss-mediated enhanced reprogramming, we performed an RNA-Seq experiment. USP22 knockout and wild-type fibroblasts were reprogrammed by OSKM expression and on day 6 of reprogramming RNA-Seq was performed. Expectedly, we observed that development-related genesets were negatively enriched whereas pluripotency-related genesets were positively enriched by USP22 loss. SOX2 target geneset was among positively enriched genesets and we hypothesized that USP22 loss activates endogenous pluripotency network earlier during reprogramming to increase its efficiency. To test this hypothesis, we collected RNA at different days of reprogramming and revealed that endogenous SOX2 levels increased up to 3-fold upon USP22 loss during reprogramming. These results show that USP22 acts as a barrier to reprogramming by suppressing endogenous pluripotency network independent from its catalytic activity and SAGA incorporation.
Benzer Tezler
- Functional and biochemical analysis of a novel deubiquitinating enzyme, USP32
Yeni bir deubikitinaz enzimi olan USP32 nin fonksiyonel ve biyokimyasal analizi
AYŞEGÜL SAPMAZ
Doktora
İngilizce
2012
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. A. ELİF ERSON BENSAN
- Functional characterization of two potential breast cancer related genes
Meme kanseri ile ilişkili iki genin fonksiyonel karakterizasyonu
SHİVA AKHAVANTABASİ
Doktora
İngilizce
2012
GenetikOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. A. ELİF ERSON BENSAN
- Investigation of the interactions between NFIB and potential binding partners MAD2B and ATXN3
NFIB proteininin potansiyel bağlanma partnerleri olan ATXN3 ve MAD2B ile etkileşiminin araştırılması
EDA YILMAZYILDIRIM
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Characterization of human babesiosis otu like protein
İnsan babesioz otu protein karakterizasyonu
BETÜL YUSUF
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyoteknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATİH KOCABAŞ
- Ventrikül kasılmasında oksidan stresin rolünün elektrofizyolojik olarak incelenmesi
The Role of oxidant stress on ventricular contraction by electrophysiological methods
ÖMER HOTOMAROĞLU
