Gıda atıklarından termofilik Bacillus licheniformiş SO7 ile üretilen alkalin proteazın manyetik alan destekli üç fazlı ayırma sistemi ile saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu
Purification and biochemical characterization of alkaline protease produced by thermophilic Bacillus licheniformis SO7 from food waste using magnetic field-assisted three phase partitioning
- Tez No: 813120
- Danışmanlar: PROF. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Proteaz, Bacillus licheniformis, atık gıda, TPP, manyetik alan, BSA, Protease, Bacillus licheniformis, food waste, TPP, magnetic field, BSA
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 116
Özet
Amaç: Günümüzde çevresel ve ekonomik açılardan hala önemli bir sorun teşkil etmekte olan gıda atıkları, mikrobiyal süreçler sonucunda biyoteknoloji ve endüstri açısından değerli bazı ürünlerin (biyoyakıtlar, biyopolimerler, biyosürfaktanlar ve enzimler gibi) elde edilmesinde substrat olarak kullanılabilmektedir. Bu tez çalışmasında; bazı gıda atıklarından Bacillus licheniformis SO7 suşu ile üretilen alkalin proteaz enziminin Üç Fazlı Ayırma (TPP) yöntemi ve yeni bir modifikasyonu olan Manyetik Alan Destekli TPP (MFTPP) ile tek adımda hızlı ve basit olarak saflaştırılması ile birlikte biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapılarak uygulanabilirliğinin gösterilmesi hedeflenmiştir. Yöntem: İlk olarak, Bacillus licheniformis SO7 (GenBank No: MG076977) suşu kullanılarak belirlenen bazı gıda atıklarından alkalin proteazın üretimi gerçekleştirildi ve en iyi üretim besiyeri seçilerek diğer çalışmalara devam edildi. Daha sonra üretilen alkalin proteazın klasik TPP ve manyetik alan destekli TPP yöntemleri ile kısmi olarak saflaştırılması gerçekleştirilerek geri kazanım üzerine etkileri karşılaştırmalı olarak incelendi. Saflaştırılan alkalin proteazın biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapılarak, sığır serum albümini (BSA) hidroliz etme potansiyeli araştırıldı. Bulgular: Alkalin proteaz enzimi için en iyi sıvı üretim besiyerinin barbunya alt suyu olduğu belirlendi. Üretilen alakalin proteaz, klasik TPP ile kısmi saflaştırılması için yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda; oda sıcaklığında (25oC), pH 10, 1.0:0.5 ham enzim çözeltisi: t-bütanol oranı, %70 amonyum sülfat doygunluğunda 30 dakikada %147 verimle 3,23 kat saflaştırıldı. Daha sonra yeni bir yöntem olan MFTPP uygulamasında manyetik alan gücü, görev döngüsü ve manyetik alan süresi parametrelerinin optimizasyonu sonucunda sırasıyla 40 W'da, %30 görev döngüsüyle 6 dk'da, %181 verimle 4 kat saflaştırma gerçekleştirildi. SDS-PAGE ile enzimin molekül ağırlığı ~55,0 kDa olarak hesaplandı. Alkalin proteaz enzimi için optimum pH 7,5 ve optimum sıcaklık 40oC olarak belirlendi. Enzimin 0-90oC sıcaklık aralığında bütün değerlerde 12 saate kadar aktiviteyi %90 üzerinde koruduğu tespit edildi. %1 ve %5'lik konsantrasyonlardaki yüzey aktif maddelerin varlığında enzimin yüksek oranda stabil kaldığı, %15 ve %50'lik konsantrasyonlarda kullanılan organik çözücülerin aktiviteyi artırdığı ve 1 mM, 5mM ve 10 mM'lık metal iyonlarının varlığında enzim aktivitesinin yüksek oranda arttığı belirlendi. B. licheniformis SO7 enziminin kazein substratı için Km, Vmax, Kcat, ve Kcat/Km değerleri sırasıyla 0,240 mg/mL, 96,15 μg.mL-1.dk-1, 1,7.10-2 s-1 ve 0,071 s-1.mM-1 olarak hesaplandı. Ayrıca saflaştırılan alakalin proteazın BSA üzerinde potansiyel hidroliz etkisi test edildi ve BSA'ni yüksek oranda parçaladığı gözlemlendi. Sonuç: Biyomoleküllerin ekonomik olarak yüksek orandaki üretimi ile birlikte kısa zamanda basit şekilde saflaştırılması endüstri açısından büyük bir önem arz etmektedir. Gelişmiş ayırma tekniklerinin kullanımı ile etkili bir saflaştırma prosesi, üretimin en önemli adımlarından birisi olup toplam üretim maliyetlerinin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır. Sonuç olarak bu tez kapsamında, manyetik alan destekli TPP'nin, alkalin proteazı klasik TPP'ye oranla yüksek verim ve saflaştırma oranı ile çok daha kısa sürede kısmi saflaştırılması için etkili ve yeni bir yöntem olduğu gösterildi. Ayrıca, B. licheniformis SO7 alkalin proteazın geniş bir sıcaklık ve pH aralığındaki aktivitesi ve kararlılığı, çeşitli metal iyonları, organik çözücüler ve yüzey aktif maddeleri varlığındaki nispeten yüksek kararlılığı ile bu enzimin endüstriyel uygulamalar için ekonomik ve uygun bir aday olduğunu göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Purpose: Food wastes, which still pose a significant environmental and economic problem today, canbe used as substrates to obtain some valuable products (such as biofuels, biopolymers, biosurfactants, and enzymes) for biotechnology and industry as a result of microbial processes. In this thesis, it was aimed to demonstrate the rapid and simple purification of alkaline protease enzyme produced from some food wastes with Bacillus licheniformis SO7 strain by Three Phase Separation (TPP) method and its new modification Magnetic Field-Assisted TPP (MFTPP) in one step and to demonstrate its applicability by performing biochemical characterization studies. Method: Firstly, alkaline protease was produced from some food wastes using Bacillus licheniformis SO7 strain (GenBank No: MG076977) and the studies were continued by selecting the best production medium. Then, partial purification of the produced alkaline protease was carried out by TPP and magnetic field-assisted TPP methods and their effects on recovery were comparatively investigated. Biochemical characterization studies of the purified alkaline protease were carried out and its applicability on Bovine Serum Albumin (BSA) was demonstrated. Findings: The best liquid production medium for alkaline protease enzyme was determined to be kidney bean broth. As a result of optimization studies for partial purification of the produced alkaline protease by conventional TPP; 3.23-fold purification with 147% efficiency in 30 minutes at room temperature (25oC), pH 10, 1.0:0.5 crude enzyme solution: t-butanol ratio, 70% ammonium sulfate saturation. Then, as a result of the optimization of the magnetic field power, duty cycle, and magnetic field duration parameters in the MFTPP application, which is a new method, 4-fold purification was achieved with 181% efficiency at 40 W, 30% duty cycle, and 6 min, respectively. The molecular weight of the enzyme was calculated as ~55.0 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH for the alkaline protease enzyme was 7.5 and the optimum temperature was 40oC. It was determined that the enzyme retained over 90% activity for up to 12 h at all values in the temperature range of 0-90oC. It was determined that the enzyme remained highly stable in the presence of surfactants at concentrations of 1% and 5%, organic solvents used at concentrations of 15% and 50% increased the activity, and the enzyme activity was highly increased in the presence of metal ions at 1 mM, 5 mM, and 10 mM. Km, Vmax, Kcat, and Kcat/Km values of B. licheniformis SO7 enzyme for casein substrate were calculated as 0.240 mg/mL, 96.15 μg.mL-1. dk-1, 1.7.10-2 s-1 ve 0.071 s-1.mM-1 respectively. In addition, the potential hydrolysis effect of the purified alkaline protease on BSA was tested and it was observed that it degraded BSA at a high rate. Conclusion: The simple purification of biomolecules in a short time with economically high production rates is of great importance for the industry. An efficient purification process with the use of advanced separation techniques is one of the most important steps in production and accounts for a significant portion of total production costs. As a result, in this thesis, magnetic field-assisted TPP was shown to be an effective and novel method for partial purification of alkaline protease in a much shorter time with a high yield and purification rate compared to classical TPP. Furthermore, the activity and stability of B. licheniformis SO7 alkaline protease over a wide range of temperatures and pH, and its relatively high stability in the presence of various metal ions, organic solvents, and surfactants indicate that this enzyme is an economical and suitable candidate for industrial applications.
Benzer Tezler
- Termofilik Bacillus licheniformis SO5'den α-amilazın manyetik alan destekli üçlü faz ayırma sistemi ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of α-amylase from thermophilic Bacillus licheniformis SO5 using magnetic field-assisted three phase partitioning
ŞEYMA ARAS
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
- Yemekhane ve hayvan atıklarından bioenerji geri kazanımı
Bioenergy recovery from dining halls waste and cattle manure
ALİ ONUR KASARCI
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MAHMUT ALTINBAŞ
- Biohydrogen production from organic wastes using anaerobic membrane bioreactor
Organik katı atıklardan anaerobik membran biyoreaktörde biyohidrojen üretimi
AYSEL HASANOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Enerjiİstanbul Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MAHMUT ALTINBAŞ
- Biogas recovery during anaerobic treatment of lignocellulose-rich pollutants with high sulphate content: an investigation via innovative applications
Yüksek sülfat içerikli lignoselüloz bakımından zengin kirleticilerin havasız arıtımı sırasında biyogaz geri kazanımı: yenilikçi uygulamalarla bir araştırma
EDA YARSUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÇİĞDEM GÖMEÇ
- Comparison of waste degradation and microbial community profiles during composting of yard waste, kitchen waste and cow manure
Bahçe atıkları, mutfak atıkları ve inek dışkısının kompostlaştırılmasında atık azalımının ve mikrobiyal komünite profillerinin karşılaştırılması
ELİF IRMAK ERDEM
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Çevre MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiÇevre Teknolojileri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BAHAR İNCE