Geri Dön

Point-of-care detection of respiratory tract infections using a novel PCR kit with gold nanoparticle-mediated dna polymerase

Altın nanopartikül aracılığıyla dna polimeraz güçlendirme yöntemi kullanan yeni bir PCR kitinin solunum yolu enfeksiyonlarının yatakta tanısına yönelik kullanımı

PDF İndir

  1. Tez No: 815265
  2. Yazar: MERT ELMAS
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Mikrobiyoloji, Moleküler Tıp, Biology, Microbiology, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Nanobilim ve Nanomühendislik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 89

Özet

Solunum yolu enfeksiyonları, burun, boğaz, bronşlar ve akciğerleri etkileyen hastalıklardır. Bu hastalıklara, virüs, bakteri ve mantar gibi mikroorganizmalar neden olabilir. SYE'ler, hafif soğuk algınlığından ciddi pnömoniye kadar geniş bir yelpazede komplikasyonlara neden olabilir. SYE'ler, özellikle yaşlılar, çocuklar ve bağışıklığı zayıflamış bireylerde daha şiddetli seyredebilir. Bu gruplar, solunum yolu enfeksiyonlarına daha sık yakalanma ve daha ciddi komplikasyonlar geliştirme riski altındadır. SYE'lerin tedavisi, enfeksiyonun nedenine bağlıdır. Örneğin, virüslerin neden olduğu enfeksiyonlar için antiviral tedavi gerekebilirken, bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlar için ise antibiyotik tedavisi gerekebilir. SYE'ler, halk sağlığı açısından önemli bir sorundur. Bu hastalıklar, her yıl milyonlarca insanı hasta eder ve milyonlarca insanın ölümüne neden olur. SYE'lerden korunmak ve tedavi etmek için kullanılabilecek, bu hastalıklardan kaynaklanan sağlık sorunlarının önlenmesine yardımcı olacaktır. SYE'lerin tanısına yardımcı olarak kullanılan yöntemler arasında kültür, PCR, serolojik testler ve radyolojik testler yer alır. Kültür yöntemi, en eski ve en yaygın yöntemdir. Bu yöntemde, solunum yollarından alınan bir örnek laboratuvar ortamında kültürlenir ve enfeksiyona neden olan mikroorganizma yetiştirilir. Kültür yöntemi, enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın tanısını koymak için kullanılır ancak kültür yöntemi, zaman alıcıdır ve bu yöntemle enfeksiyona neden olan mikroorganizma her zaman tespit edilemeyebilir. PCR yöntemi, solunum yolu enfeksiyonlarının tanısında kullanılan daha yeni bir yöntemdir. Bu yöntemde, solunum yollarından alınan bir örnekte enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın genetik materyali (DNA veya RNA) çoğaltılır. PCR yöntemi, kültür yöntemine göre daha hızlı ve daha hassastır ve bu yöntemle enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın her zaman tespit edilebilmektedir. Serolojik testler, enfeksiyona karşı oluşan antikorları tespit etmek için kullanılır. Serolojik testler, enfeksiyondan sonra birkaç hafta içinde pozitif sonuç verebilirler ancak bu testler, enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın kesin tanısını koymak için kullanılamazlar. Radyolojik testler, solunum yollarında meydana gelen değişiklikleri tespit etmek için kullanılır. Radyolojik testler, enfeksiyonun şiddetini ve dağılımını değerlendirmek için kullanılabilirler ancak bu testler, enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın kesin tanısını koymak için kullanılamazlar. PCR yöntemi, SYE tanısında en yaygın ve en hızlı yöntemdir. Bu yöntem, enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın genetik materyalini çoğaltarak çalışır ve bu sayede enfeksiyona neden olan mikroorganizmanın kesin tanısını koymak için kullanılabilir. PCR yöntemi, diğer yöntemlere göre daha hassastır ve bu nedenle solunum yolu enfeksiyonlarının tanısında tercih edilir. PCR, moleküler biyolojide çok önemli bir araç olmasına rağmen, bazı dezavantajlarını da beraberinde getirir. Bu dezavantajlardan bazıları şunlardır: Reaktiflerin saklama koşulları, PCR reaktifleri, stabiliteyi korumak için belirli sıcaklık ve nem koşullarında muhafaza edilmelidir. Bu, özellikle laboratuvarlarda sıkça yaşanan elektrik kesintileri veya don-çöz döngüleri gibi olaylarda reaktiflerin bozulmasına neden olabilir. Bu nedenle, dikkatli bir saklama ve taşıma süreci gereklidir. Nükleik asit ekstraksiyonu gereksinimi, PCR işlemi için hedeflenen DNA veya RNA'nın ekstraksiyonu gerekir. Bu, örneğin kan, doku veya tükürük gibi biyolojik materyallerin uygun şekilde işlenmesini ve nükleik asitlerin elde edilmesini içerir. Bu adım, zaman alıcı ve karmaşık olabilir ve yanlış yapıldığında yanıltıcı sonuçlara neden olabilir. Ayrıca, PCR cihazları ve laboratuvar ekipmanları da maliyetli olabilir. Bu yüksek maliyet, bazı laboratuvarların PCR işlemini kullanmasını kısıtlayabilir. PCR, çok adımlı bir işlemdir ve deneyimli personel tarafından doğru bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Deneyimsiz kullanıcılar, hatalı çalışmalar veya kontaminasyon riski ile karşılaşabilir. Tüm bu dezavantajlara rağmen, PCR, tıbbi teşhislerde, genetik araştırmalarda, suçluların kimlik tespitinde ve birçok diğer uygulamada çok değerli bir araç olarak kullanılmaktadır. Uygun kalite kontrol ve doğru uygulama ile bu dezavantajların etkisi azaltılabilir ve PCR'nin avantajlarından yararlanılabilir. Nanopartiküller, son yıllarda PCR ve diğer moleküler biyoloji tekniklerinde kullanımı artan ilgi çeken materyallerdir. Nanopartiküller, genellikle 1 ila 100 nanometre arasında değişen boyutlarda olan yapısal özelliklere sahip nanometre ölçeğindeki malzemelerdir. PCR ile birleştirildiğinde, nanopartiküller çeşitli avantajlar sağlar ve moleküler tanı ve tespit tekniklerinin etkinliğini artırabilir. Altın nanopartiküllerin sahip olduğu yüksek yüzey hacim oranı, DNA polimeraz ile olan tersinir etkileşimi ve sahip olduğu yüksek ısı kapasitesi sebebiyle PCR reaksiyonunun verimini iyileştirmek amacıyla kullanılabilecek önemli bir aday haline gelmiştir. Bu çalışmada, SARS-CoV-2, İnfluenza A virüsü, İnfluenza B virüsü, Respiratuvar Sinisityal Virüsü (RSV) A/B, İnsan Adenovirüsü, İnsan Rinovirüsü ve Streptococcus pyogenes'in tespiti için altın nanopartikül aracılığıyla DNA polimeraz etkinliğini artırılan bir RT-qPCR kiti geliştirilmiştir. Bu kapsamda, altın nanopartikül destekli RT-qPCR kiti tasarlanmış, optimize edilmiş ve aynı altın nanopartikülsüz (AuNPs) üretilmiş RT-qPCR kitine kıyasla analitik performansını doğrulama çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar, altın nanopartikül konsantrasyonunun DNA polimeraz aktivitesini artırmak için en uygun seviyeyi belirlemeye yönelik optimizasyon çalışması, kitin tespit limitini belirlemek için ön tespit limiti analizi, tespit limiti analizi ve araştırma örneklerinde bulunan hedef analiti yanıltıcı etkiler olmaksızın doğru bir şekilde tanımlayabilme yeteneğini değerlendirmek için inklüzyon ve eksklüzyon testlerini içermektedir. Bu çalışmalar, kitin özgüllüğü ve hedef analiti doğru bir şekilde tanımlama yeteneği hakkında önemli kanıtlar sunmaktadır. Ayrıca, kitin saklama koşullarındaki stabilitesini değerlendiren ayrı bir çalışma yapılmıştır. Bu çalışmaların sonuçları, PCR kitinin performansını ve güvenilirliğini artırmada önemli bir rol oynamaktadır. Öncelikli olarak kullanılacak olan altın nanopartiküllerin ideal konsantrasyonu için farklı konsantrasyonlar ile PCR kitinin bileşenleri kullanılarak optimizasyon çalışması yapılmış ve ideal AuNP konsantrasyonu 2 nM olarak bulunmuştur. Daha yüksek konsantrasyon denendiğinde ise PCR reaksiyonun performansında inhibisyon gözlemlenmiştir. Kullanılacak olan AuNP konsantrasyonu belirlendikten sonra, referans materyaller ve araştırma örnekleri kullanılarak ön tespit limiti ve tespit limiti çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, seri dilüsyon yapılarak PCR testinin hedef organizmaları belirli oranlarda negatif araştırma örneklerine eklenmiştir. Yapay kontaminasyon ile üretilen araştırma örnekleri vNAT® Transfer Tüpü kullanılarak ekstrakt edilmiş ve belirlenmiş olan termal protokol ile qPCR cihazında çalıştırılmıştır. Yapılan tespit limiti çalışmaları sonucunda PCR kitinin 250 cp/mL değerinde bir tespit limitine sahip olduğu bulunmuştur. Daha sonra, referans materyaller ile yapılan dahil edicilik ve dışlayıcılık çalışmalarında kitin hedeflediği analitleri bulabildiği ve hedef dışı analitler ile çapraz reaksiyon vermediği tespit edilmiştir. Bir sonraki adım olarak, solunum yolu örneklerinde karşılabilecek maddelerin kitin performansına etkisin gözlemlemek amacıyla, yapay kontaminasyon ile elde edilmiş araştırma örneklerine belirlenmiş maddeler belirli konsantrasyonlarda eklenmiştir. Seçilen bazı maddelerin kitin performansını etkileyebileceği görülmüştür. Son olarak yapılan stabilite çalışmalarında ise, RIDK-2 testi altın nanopartiküllü ve altın nanopartikülsüz olacak şekilde 2 farklı formda üretilmiştir. Üretilen her iki kit için de referans materyaller ile yapay olarak kontamine edilmiş araştırma örnekleri kullanılarak 72 saat boyunca her saat ayrı analizler gerçekleştirilmiştir. Testler sonucunda altın nanopartikül olmadan üretilen testin oda sıcaklığında 6 saat, altın nanopartikül kullanılarak üretilen testin ise 72 saate yakın stabil kalabildiği tespit edilmiştir. Geliştirilen bu kit, yüksek duyarlılık ve özgüllük göstererek yukarıda belirtilen hedef SYE patojenlerini tespit etme konusunda daha üstün analitik performansa sahip olduğunu göstermiştir. RIDK-2, nükleik asit izolasyonuna gerek duymadan bir saatin altında bir sonuç verme süresine sahiptir ve çapraz reaktivite göstermemiştir. Altın nanopartikül destekli PCR kitinin hızlı sonuçlanma süresi ve doğruluğu, SYE'lerin zamanında teşhisine yardımcı olması için bu kitin güvenle kullanılabileceğine, böylece yoğun bakım ünitesine yatma riskini ve ölüm oranını azaltılabileceğine işaret etmektedir. Ayrıca, stabilite çalışmaları, altın nanopartikül destekli PCR kitinin 72 saate yakın stabil kaldığını göstermiştir. Bu durum, özel ekipman ve soğutma imkanının hemen bulunamadığı pediatrik klinikler de dahil olmak üzere kliniklerde kullanım için gayet uygun olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, altın nanopartikül destekli PCR kitinin SYE'lerin yönetimini önemli ölçüde geliştirme potansiyeline sahip olduğunu, böylece hasta koşullarını iyileştirip sağlık maliyetlerini azaltabileceğinide göstermektedir.

Özet (Çeviri)

Respiratory tract infections (RTIs) are common and can cause a wide range of illnesses, from mild colds to severe pneumonia, bronchitis, and other respiratory diseases. RTIs are a significant burden on public health, with high morbidity and mortality rates, particularly in vulnerable populations such as the elderly, children, and immunocompromised individuals. However, current diagnostic methods for respiratory tract infections (RTIs) are often time-consuming and require specialized equipment and trained personnel, resulting in long turnaround times and delays in treatment. In order to address this challenge, we developed a novel PCR kit for the detection of SARS-CoV-2, Influenza A virus, Influenza B virus, Respiratory Syncytial Virus (RSV) A/B, Human Adenovirus, Human Rhinovirus and Streptococcus pyogenes named Respiratory ID Panel 2 (RIDK-2), that uses gold nanoparticles to enhance DNA polymerase activity, thereby improving the sensitivity and specificity of RTI detection. In this study, we designed and optimized the gold nanoparticle-enhanced PCR kit and validated its analytical performance compared to same RT-qPCR kit produced without golden nanoparticles (AuNPs), including preliminary limit of detection (LoD), LoD, wet and in-silico inclusivity, wet and in-silico exclusivity, and stability studies. The kit demonstrated superior analytical performance, with high sensitivity and specificity for detecting target RTI pathogens mentioned above. The RIDK-2 has a turnaround time under 1 hour without the need of nucleic acid extraction with a LoD of 250 cp/mL for research samples prepared using reference materials and the kit showed no cross reactivity. The rapid turnaround time and accuracy of the gold nanoparticle-enhanced PCR kit make it a valuable tool for the timely diagnosis of RTIs, reducing the risk of intensive care unit admission and death. Furthermore, stability studies showed that the kit without gold nanoparticles could be stored at room temperature for up to 6 hours without significant loss of performance, while the gold nanoparticle-enhanced PCR kit was stable for up to 72 hours, making it suitable for use in clinics, including pediatric clinics, where specialized equipment and refrigeration may not be readily available. According to the analytical performance studies the kit's sensitivity and specificity was found as 99.74% and 99.61%. These findings suggest that the gold nanoparticle-enhanced PCR kit has the potential to significantly improve the management of RTIs, thereby enhancing patient outcomes and reducing healthcare costs.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    496436

    Tüberküloz teşhisi için kullanılmak üzere mikro ısıtıcı tasarlanması karakterizasyonu ve üretimi

    Microheater design production and characterisation for using in tuberculosis detection

    MUHAMMED BEKİN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. LEVENT TRABZON

  2. Tez No

    455776

    Boğmaca ve viral alt solunum yolu enfeksiyonu tanısı alan hastaların klinik ve laboratuar özelliklerinin karşılaştırılması

    Comparison clinical and laboratory features of the patients wi̇th bordetella pertussi̇s and vi̇ral i̇llnesses

    SUNA KAYMAK

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıAnkara Üniversitesi

    Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERGİN ÇİFTCİ

  3. Tez No

    751189

    The effect of concentration of biological fluids by hydrophilic elastic polymer beads on the sensitivity of SARS-CoV-2 diagnosis by real-time PCR

    Hidrofilik elastik polimer boncuklar tarafından biyolojik sıvıların konsantrasyonunun izlenebilir polimeraz zincirleme tepkimesi kullanılarak SARS-CoV-2 tanısının duyarlılığına etkisi

    DİLARA ÇANKAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyoteknolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi

    Medikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZÜHTÜ TANIL KOCAGÖZ

  4. Tez No

    788261

    Kritik hastalarda ekstrakorporeal sitokin eliminasyonunun hemodinami ve mortalite üzerine etkileri

    Effects of extracorporeal cytokine elimination on hemodynamia and mortality in critical patients

    HAKAN KÜÇÜKKEPECİ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Anestezi ve ReanimasyonSağlık Bilimleri Üniversitesi

    Anesteziyoloji ve Reanimasyon Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NAMİGAR TURGUT

  5. Tez No

    789553

    COVID-19 tanısına yönelik yenilikçi altın-LSG elektrotlar ile akıllı telefon tabanlı taşınabilir elektrokimyasal biyosensör sistemlerinin geliştirilmesi

    Development of smartphone based portable electrochemical biosensor systems for COVID-19 diagnosis using innovative gold-LSG electrodes

    DUYGU BEDÜK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiEge Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SUNA TİMUR

Geri Dön