Sağlıklı ve kanserli meme hücre hatlarında biyotinilasyon yardımıyla karşılaştırmalı sekretom analizi
Comparative secretome analysis with the aid of biotinylation in healthy and cancerous breast cell lines
- Tez No: 847488
- Danışmanlar: DOÇ. DR. GÜRLER AKPINAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Breastcancer, Endoplasmicreticulum, Secretome, TurboID
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 98
Özet
Meme kanseri insidansı ve mortalitesi yüksek olan genellikle kadınlarda görülen ve GLOBOCAN 2020 veri analizlerine göre akciğer kanserinden sonra en çok görülen kanser türüdür. Kanser hücrelerinin normal hücrelere kıyasla bulundukları nişi değiştirdikleri ve enzimler, büyüme faktörleri ve hücreler arası matriks proteinleri gibi farklı molekülleri hücre dışına salgıladıkları bilinmektedir. Bu moleküler immün sistemden kaçış, hipoksik çevrenin oluşturulması, matestaz ve invazyon gibi pek çok farklı süreçte kritik roller üstlenmektedir. Bu nedenle normal hücrelere kıyasla kanser hücrelerinde değişiklik gösteren salgı moleküllerinin belirlenmesi hem süreç içerisindeki mekanizmaların anlaşılması hem de bu mekanizmaların hedeflenmesi ile tanı ve tedavi alanlarında yeni hedeflerin ortaya çıkartılması için oldukça önemlidir. Kanser hücre biyolojisinin anlaşılmasında ve tanıya yönelik biyobelirteçlerinin keşfinde sekretom proteinleri değer taşımaktadır. Ancak hücre kültüründe yapılan sekretom analizinde karşılaşılan bazı zorluklar mevcuttur. Kısaca özetlemek gerekirse; hücre kültürü medyasındaki sekretom proteinlerinin yüksek dilüsyonu, hücre lizizi ve hücre ölümü kaynaklı proteinlerin sekretom proteinleri ile karışması sonucu salgı proteinlerinin maskelenmesi, kültür medyasında bulunan serum proteinlerinin salgı proteinlerini baskılaması dolayısı ile yaşanan güçlükler literatürdeki çalışmalarda yer almaktadır. Bu tez çalışmasında, salgı proteinlerininin endoplazmik redikulumda (ER) biyotinilasyon aracılığla işaretlenmesi ve daha sonrasında kültür medyasından biyotinile haldeki salgı proteinlerinin streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak zenginleştirilmesi amaçlanmıştır. Böylece ölü hücrelerden salınan proteinlerin ve sitozolik proteinlerin, salgı proteinlerini maskelemesinin önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda biyotinilasyon gerçekleştiren TurboID biotin ligaz enzimi kullanılmıştır. Sağlıklı meme epital hücresi MCF-10A, non-invaziv özellikteki MCF-7 ve invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerine pDisplay_KDEL_ER_TurboID plazmiti transfekte edilmiş ve Geneticin antibiyotiği ile seçilim yapılmıştır. Hücreler uygun yoğunluğa geldiğinde 300mM ATP, 500mM MgCl2, 50mM biotin, %2 FBS içeren medyada 16 saatlik biyotinilasyon reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Immünfloresan boyamalarla TurboID ifadesi ve ER proteinlerinin biyotinilasyonu gösterilmiştir. Sekretom ortamından biyotinile haldeki proteinler streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. Biyotinilasyonun etkinliği, sekretom örneklerinde Western Blot (WB) analizleri yapılarak doğrulanmıştır. nLC-MS/MS analizleri sonucunda invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerinde non-invaziv özellikteki MCF-7 hücrelerine kıyasla yukarı regüle olan 5 adet protein tanımlanmıştır. Bu proteinler arasından Kardiyak Troponin I protein ekspresyonu hücre özütleri, sekretom örnekleri ve doku örneklerinde WB analizleri yapılarak incelenmiştir. nLC-MS/MS ve WB analizleri sonucunda, troponin sekrasyonunun invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerinde daha fazla olduğu saptanmıştır. Elde ettiğimiz bu sonuç literatürde yer alan troponin ve kanser ilişkisini destekler ve tamamlayıcı nitelikte bilgiler edinilmiştir. Bu tez çalışmasında tanımlanmış olan metaztaz ile ilişkilendirilebilecek proteinler sayesinde literatüre güncel bilgiler kazandırılmış ve meme kanseri tanı ve tedavisine yönelik çalışmalara öncülük edebilecek veriler elde edilmiştir. Anahtar kelimerler: Endoplazmikretikulum, Meme kanseri, Sekretom, TurboID
Özet (Çeviri)
According to GLOBOCAN 2020 data analysis, it is the most common type of cancer after cancer with a high incidence and death of breast cancer. They are known to change the niche in which they compare usual constraints of cancer growth and to produce different types of cells such as enzymes, growth replications and interstructural matrix proteins. These departments play critical roles in many different processes such as escape from the immune system, regulation of the hypoxic environment, metastasis and invasion. Therefore, comparing normal structures and identifying the secretory regions that show changes in cancer cells is very important both throughout the processes and targeting these results for the diagnosis and revealing extremely new goals. Secretome proteins hold value in the maintenance of cancer cell biology and in the control of recognition biomarkers. However, there are some difficulties in secretome analysis in cell cells. To summarize; High dilution of the secretome proteins in the cell culture media, masking the secretome proteins released as a result of the effects of the proteins originating from cell lysis and cell death, and suppressing the proteins released by the serum proteins in the culture media are among their duties in the literature. This thesis is designed for the purpose of labeling secretory proteins in the endoplasmic reticulum (ER) via biotinylation and then enriching the biotinylated secretion proteins from culture media using streptavidin-coated magnetics. Thus, it is aimed to prevent the masking of secretory proteins and cytosolic proteins released from dead organisms. TurboID biotin ligase enzyme was used, which performs biotinylation in these cells. Healthy breast epithelial groups MCF-10A, non-invasive MCF-7 and invasive MDA MB 231 cells were transfected with pDisplay_KDEL_ER_TurboID plasmid and formed with Geneticin antibiotic. When it became dense enough for cells, it did not perform 16 biotinylations in media containing 300mM ATP, 500mM MgCl2, 50mM biotin and 2% FBS. Based on TurboID expression and biotinylation of ER proteins by immunofluorescent staining. Biotinylated proteins from the secretome medium were enriched using streptavidin-coated magnetic beads. The success of biotinylation was verified by structuring Western Blot (WB) analyses on secretome samples. As a result of nLC-MS/MS analysis, invasive MDA MB 231 cells have 5 proteins that are regulated above according to the non-invasive MCF-7 chart. Among these proteins, Cardiac Troponin I protein expression was investigated by performing WB analyses in cell extracts, secretome samples and tissue samples. As a result of nLC-MS/MS and WB analysis, the invasive feature of troponin secretion is more in MDA MB 231 cells. This result we obtained has realized the relationship between troponin and cancer in the literature and got permanent information. Thanks to the proteins that can produce proteins with metastasis, which defines the individuals of this thesis, up-to-date information has been brought to the literature and the main points of the sections for the diagnosis and treatment of the breast part have been obtained.
Benzer Tezler
- Meme kanseri hücre hatlarında karşılaştırmalı yüzey proteom analizi
Comparative surface proteome analysis in breast cancer cell lines
MEHMET SARIHAN
Doktora
Türkçe
2023
Tıbbi BiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT KASAP
- Investigation of the localization pattern and the role of anti apoptotic BAG-1 in healthy and tumor tissues from patients with breast carcinoma
Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik BAG-1 proteininin rolü ve lokalizasyonunun incelenmesi
JALE YILDIZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Multi-gene regulation using DNA-origami-AuNPs nanostructures in breast cancer cells
DNA origami-AuNPs nanoyapıları kullanılarak meme kanseri hücrelerinde çoklu gen anlatımının düzenlenmesi
CANSU ÜMRAN TUNÇ
Doktora
İngilizce
2019
Bilim ve TeknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA ÇULHA
- Başlatıcılı kimyasal buhar biriktirme yöntemi ile etkiye duyarlı ince filmlerin sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of stimuli-responsive thin films by initiated chemical vapor deposition method
EMİNE SEVGİLİ MERCAN
Doktora
Türkçe
2023
Kimya MühendisliğiKonya Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA KARAMAN
- Meme kanserler hücre hatlarında NEAT1 ekspresyon seviyesinin doksorubisin direnci ile ilişkisinin araştırılması
Investigation of the relationship between NEAT1 expression level and doxorubicin resistance in breast cancer cell lines
ZAHRA AZIZI
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Tıbbi BiyolojiPamukkale ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İBRAHİM AÇIKBAŞ