Comprehensive transcriptomic and genomic analysis of oxidative stress-resistant saccharomyces cerevisiae
Oksidatif strese dirençli saccharomyces cerevısıae suşunun transkriptomik ve genomik analizi
- Tez No: 848275
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 187
Özet
Oksidatif stres; organizmadaki oksidant ve antioksidant dengesinin oksidantlar yönünde bozularak oksidantların potansiyel olarak hasara neden olabilecek konuma gelmesi olarak nitelendirilmektedir. Aerobik organizmalar oksijen kullanarak solunum yapmakta ve enerji ihtiyacına yönelik olarak besinleri okside etmek için oksijen kullanmaktadırlar. Bu sebepten ötürü oksijen, aerobik canlılar için gerekli olmakla birlikte, bu süreçte oluşan reaktif oksijen türleri (ROS) nedeni ile zararlı da olabilmektedir. Canlılığın temelini oluşturan lipid, protein ve DNA molekülleri ROS'ların oluşturduğu oksidatif stres nedeniyle doğrudan veya dolaylı olarak zarar görebilmektedir. ROS, dioksijenin (O2) farklı durumlarından meydana gelmektedir. Oksijenli solunum süresince üretilen en önemli ROS'lar süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve reaktif hidroksil radikalleridir. Aerobik canlılar oksidatif stresin zararlı etkilerinden korunmak amacıyla çeşitli mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bu mekanizmalar; enzimatik ve enzimatik olmayan (antioksidanlar) mekanizmalar olarak ikiye ayrılır. Organizmalar, bu mekanizmaların yanında özellikle DNA hasarını gidermek için çeşitli tamir mekanizmaları da kullanırlar. ROS'tan kaynaklı oksidatif stres memelilerde bir çok nörodejeneratif ve otoimmün hastalıklara neden olduğu gibi, kardiyovasküler hastalıklar, kanser ve yaşlanmaya da sebebiyet verdiği için biyomedikal açıdan önemlidir ve geniş kapsamlı olarak araştırılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae mayası, kısa yaşam süresine sahip olması ve tek hücreli olması dolayısıyla kolaylıkla genetik olarak manipüle edilebilir ve bu nedenle bilimsel çalışmalarda model organizma olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Bunun yanında S. cerevisiae'nin ökaryotik bir organizma olması ve doğada diploid, haploid, ya da poliploid olarak bulunabilmesi de ökaryotik kompleks organizmalardaki proseslerin aydınlatılması için S. cerevisiae'yi önemli bir model organizma konumuna getirmektedir. Metabolik mühendislik, 1991 yılında Bailey tarafından, hücrelerin enzimatik, taşınım ve regülasyon fonksiyonlarının rekombinant DNA teknolojisinin kullanılmasıyla değiştirilerek, hücresel aktivitelerin geliştirilmesi olarak tanımlanmıştır. Evrimsel mühendislik ise, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olup, istenen fenotipik özelliklerin çevresel stres uygulamaları ve uygun seçilim stratejisi kullanılarak yapay bir evrimsel süreç ile elde edilmesine dayanmaktadır. Bu yöntem ile elde edilen, özellikleri iyileştirilmiş mikroorganizmanın fenotipi karakterize edilip, incelenen özellikler genetik, transkriptomik, fizyolojik ve proteomik çalışmalarla aydınlatılabilir. Bu çalışmanın amacı; bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik ile daha önceki çalışmalar ile elde edilmiş olan, oksidatif strese dirençli bir S. cerevisiae mutant mayasının genomik ve transkriptomik düzeyde karakterize edilmesidir. Asıl amaç ise, oksidatif stres direncinin karmaşık moleküler altyapısının kapsamlı olarak incelenmesidir. Ayrıca fizyolojik analiz olarak hücre duvarı yapısına dair de analiz gerçekleştirilmiş ve stresin hücre duvarı yapısı üzerindeki etkisi hakkında bilgi sahibi olunmuştur. Çalışmada kullanılan mutant maya, daha önceki çalışmalarda evrimsel mühendislik ile elde edilmiştir. Kısaca, önce başlangıç kültürü EMS'ye (etil metan sülfonat) tabi tutularak genomda rastgele mutasyonlar oluşması sağlanmış, daha sonra kültürlerden alınan pasajlar sürekli ve giderek artan düzeyde hidrojen peroksit stresine (oksidatif stres) maruz bırakılmıştır. EMS ile oluşturulan rastgele mutasyonlar, hidrojen peroksit uygulaması ve stres direnç testleri ile seleksiyon sağlanmış, oksidatif strese dirençli bir birey seçilmiştir. Bu süreçte oksidatif strese dirençli mutant S. cerevisiae suşu ve referans suşun mikroarray yöntemiyle oluşturulan transkriptomik profillerinin karşılaştırılması ile mutant S. cerevisiae'nin transkriptomik analizleri gerçekleştirilmiştir. Genomik analiz olarak, oksidatif strese dirençli suş ile referans suşun tüm genomları dizilenmiş ve mutant suşun genomunda evrimsel mühendislik sürecinde oluşmuş olan farklılıklar belirlenmiştir. Genomik ve transkriptomik analizler ile birlikte ESR (çevresel stres direnci) analizleri, KEGG analizi ile yolak analizleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca transkriptomik verileri ile otofaji genleri analizi yapılmıştır. Mutant suşta nonsense (anlamsız) mutasyona uğramış bir transkripsiyon baskılayıcı gen olan NRG1 geni tarafından regüle edilen genler de analiz edilmiştir. Bunun yanında litikaz duyarlılık testi ile, referans suş ile mutant suşun hücre duvarı analizleri gerçekleştirilmiştir. Transkriptomik analiz sonucunda oksidatif strese dirençli mutantta 869 genin 2 kat ve üzerinde, 349 genin 3 kat ve üzerinde, 144 genin 4 kat ve üzerinde, 67 genin 5 kat ve üzerinde ekspresyon değişimi gösterdiği gözlenmiştir. 2 kat ve üzeri değişen 869 genden 459 genin ekspresyonu artmış, 410 genin ekspresyonu da azalmıştır. Ekspresyonu azalan genler genellikle; ribozomal RNA, nukleus taşınımı, organel bütünleşmesi, tRNA hücre döngüsü, mitoz ve RNA polimeraz ile ilgilidir. Stres cevap genleri, kabronhidrat, lipit, protein, öncül metabolitler ile iyon ve metabolit taşınımı ile ilgili genlerin ekspresyonları ise mutant suşta genellikle artmıştır. ESR analiz sonucuna göre ise veri tabanı bilgilerine göre ESR ile indüklenen genler ile oksidatif strese dirençli mutantın ekspresyon düzeyi artmış genleri arasında pozitif korelasyon gözlenmiştir. Ayrıca ESR ile baskılanan genler ile mutantın ekspresyonu azalmış olan genleri arasında da pozitif korelasyon belirlenmiştir. Beklenildiği üzere, stres cevap genleri analizine göre kimyasal stres, oksidatif stres, sıcaklık stresi, osmotik stres, glikoz limitasyonu stresi ve açlık stresine cevap genlerinin ekspresyonu artmıştır. Oksidatif strese dirençli mutant mayanın, ekpresyon düzeyleri 2 kat ve üstü değişen genleri oksidatif stres genleri açısından incelendiğinde, bunların iki tanesinin ekspresyonun azaldığı yirmiüç tanesinin ise ekspresyonun arttığı gözlenmiştir. Oksidatif strese dirençli mutantta otofaji ile ilişkili olan altı adet genin ekpresyonu azalmış, otuz adedinin ise artmıştır. Genomik analizler incelendiğinde; mutant suşta genler üzerinde 34 yanlış anlamlı (missense), 2 anlamsız (nonsense), 1 delesyon, 12 adet de sessiz (silent) mutasyon bulunmuş olup, 13 adet mutasyon da genlerin dışında kalan kromozomal bölgelerde saptanmıştır. Bir transkriptomik regülatör olan NRG1 genindeki anlamsız mutasyon ise, yarım kalmış (truncated) bir protein oluşmasına neden olmaktadır. Mutant suşta anlamsız mutasyonun görüldüğü diğer gen ise DUF1 genidir. Bu gen, fonksiyonu tam olarak bilinmeyen bir ubikitine bağlanan protein (ubiquitine-binding protein) kodlamakta olup, mutasyonun gerçekleştiği ve protein sentezinin durduğu nokta, proteinin işlevinin esas gerçekleştirildiği WD40 domeynine oldukça uzaktır. Gelecek çalışmalarda tek başına bu mutasyona uğratılmış referans suş ile mutasyonun işlevi ve hatta proteinin işlevi konusunda bilgi sahibi olunabilir. Benzer şekilde, DUF1 gibi diğer mutasyonlar da, özellikle gen içerisinde meydana gelen yanlış anlamlı ve sessiz mutasyonlar ile delesyonlar referans suşta birer birer veya çeşitli kombinasyonlarla meydana getirilip fizyolojik ve/veya genomik, transkriptomik ve proteomik çalışmalar ile incelenebilir. Yolaklar daha kesin bilgiler ile aydınlatılabilir ve böylelikle fonksiyonları tam bilinmeyen proteinler ve genler hakkında bilgi sahibi olunabilir.
Özet (Çeviri)
Oxidative stress occurs as the oxidant and antioxidant balance in an organism is disrupted in the direction of oxidants, and oxidants come to a position that can potentially cause damage. All aerobic organisms use oxygen for respiration and oxidation of nutrients for producing energy. For this reason, while oxygen is necessary for aerobic organisms to live, it is also harmful because of the reactive oxygen species (ROS) that emerge during these processes that are necessary for life. Lipid, protein and DNA molecules, which form the basis of life, can be damaged directly or indirectly due to oxidative stress caused by ROS. Aerobic organisms have developed various mechanisms to protect themselves from the harmful effects of oxidative stress. These mechanisms involve enzymatic and non-enzymatic (antioxidants) systems. In addition to these mechanisms, organisms use various repair mechanisms, especially to repair damaged DNA. Oxidative stress from ROS is biomedically important and widely researched, as it causes many neurodegenerative and autoimmune diseases, as well as cardiovascular diseases, cancer, and aging in mammals. The yeast Saccharomyces cerevisiae is used as a model organism, because of its beneficial characteristics. S. cerevisiae, which is a eukaryotic organism, has a short-life span. It is a single cell organism and can be found as haploid, diploid or polyploid in nature. Thus, S. cerevisiae is an important model organism for elucidating the processes in eukaryotic complex organisms. The aim of this study was to characterize an oxidative stress-resistant mutant S. cerevisiae strain at genetic and transcriptomic levels. The main idea, however, was to comprehensively examine the complex molecular infrastructure of oxidative stress resistance. In addition, as a physiological analysis, the cell wall properties of the mutant strain was also tested and information was obtained about the effect of stress on the cell wall structure. In this thesis study, transcriptomic analysis of the mutant S. cerevisiae was performed by comparing the transcriptomic profiles of the oxidative stress-resistant, evolved S. cerevisiae and the reference strain. Transcriptomic data of the strains were obtained by microarray analysis. As a genomic analysis, the entire genomes of the oxidative stress-resistant strain and the reference strain were sequenced and the differences in the genome were determined to find the mutations in the evolved srain that are related to oxidative stress resistance. In addition, cell wall analyses of the reference strain and the mutant strain were performed, using lyticase susceptibility test. As a result of transcriptomic analysis, it was observed that the expression level of 869 genes changed by at least 2-fold, 349 genes changed by at least 3-fold, 144 genes changed by at least 4-fold, and 67 genes changed by at least 5-fold in the oxidative stress-resistant mutant. Among these 869 genes that were differentially regulated by 2 times or more, 459 genes were upregulated and 410 genes were downregulated. The genes whose expression were decreased are generally related with ribosomal RNA, nuclear transport, organelle integration, tRNA cell cycle, mitosis and RNA polymerase. Expression levels of stress response genes, carbohydrates, lipid, protein, precursor metabolites and ion/metabolite transport-related genes were generally increased in the mutant strain. According to the ESR analysis results, a positive correlation was observed between the ESR-induced genes and the genes of the oxidative stress- resistant mutant with increased expression, according to the database. In addition, a positive correlation was observed between ESR-suppressed genes and genes of the mutant with decreased expression. The expression levels of two genes related to oxidative stress decreased and twenty three of them increased in the oxidative stress-resistant, evolved strain. The expression levels of six autophagy-related genes in the oxidative stress-resistant mutant decreased and 30 of them increased. According to whole genome sequencing results, 34 missense, 2 nonsense, 1 deletion and 12 silent mutations were found in the genes of the mutant strain, and 13 mutations were detected in chromosomal regions outside the coding regions. A nonsense mutation in the NRG1 gene, which is a transcriptomic regulator, results in the formation of a truncated protein. Further genomic and proteomic studies would be necessary to clarify the role of these genes and mutations in the oxidative stress resistance.
Benzer Tezler
- Omic analyses of stress-resistant Saccharomyces cerevisiae
Strese dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin omik analizleri
ENES FAHRİ TEZCAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
PROF. DR. ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN
- Molecular characterization of phenylethanol resistance in Saccharomyces cerevisiae
Feniletanol direncinin Saccharomyces cerevısıae'de moleküler karakterizasyonu
CAN HOLYAVKİN
Doktora
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Sendromik olmayan otizm spektrum bozukluğu tanılı ikisi de etkilenmiş ikiz çocuk ve ergenlerin ve anne-babalarının genomlarının ve transkriptonlarının tüm genom dizileme ve RNA dizileme yöntemi ile analizi
Whole genome analysis of dizygotic twins diagnosed with 'non-syndromic' autism spectrum disorder and their parents
PELİN ÜNAL VARIŞ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2018
PsikiyatriDokuz Eylül ÜniversitesiÇocuk ve Ergen Ruh Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SUHA MİRAL
- Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşmalı kütle spektrometrisinde yapılacak proteolitik parçalanma temelli proteomik çalışmaları için, enzim immobilize edilmiş sol-jel yüzeylerin geliştirilmesi
Development of proteolytic enzyme immobilized sol-gel target surfaces for digestion based proteomic studies in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
ÖZLEM DEMİREL
- Uncovering structural genomic contents of wheat
Buğdayın yapısal genomik içeriklerinin ortaya çıkarılması
HALİSE BÜŞRA ÇAĞIRICI
Doktora
İngilizce
2019
BiyomühendislikSabancı ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. LEVENT ÖZTÜRK
PROF. DR. HİKMET BUDAK