Streptomyces clavuligerus'ta AdpA pleiotropik regülatörünün antibiyotik biyosentezi üzerine etkisinin belirlenmesi
Determination of the effect of AdpA pleiotropic regulator on antibiotic biosynthesis in streptomyces clavuligerus
- Tez No: 883015
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ondokuz Mayıs Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 238
Özet
Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) tunikamisin, sefamisin C (CephC) ve klavulanik asit (CA) gibi çok sayıda önemli sekonder metabolitin üreticisidir. Çalışmamız kapsamında literatürde ilk defa, S. clavuligerus'ta AdpA pleiotropik regülatörünün, antibiyotik biyosentezi ve üretimi üzerindeki etkisi RNA-seq analiziyle araştırılmıştır. SceI meganükleaz yöntemiyle adpA geni silinen mutant suş (S. clavuligerus ΔadpA), yabanıl suş (S. clavuligerus NRRL 3585), çok kopyalı adpA genine sahip rekombinant suş (S. clavuligerus pSPGadpA) ve bu suşun vektör kontrolü (S. clavuligerus pSPG)'ne ait TYD kültürleriyle (T48) yapılan RNA-seq analizinde gen ifadelerindeki farklılıkların global düzenleme mekanizmaları, metabolizma yolakları, sekonder metabolit ve antibiyotik biyosentez yolakları, membran taşınım ve sinyal iletim kategorilerinde yoğunlaştığı belirlenmiştir. Tunikamisin biyosentetik gen kümesinde tunABCDEH ve tunF, tunG ve tunL genlerinin ifadeleri mutantta yabanıl suşa kıyasla daha yüksekken S. clavuligerus pSPGadpA'da genel olarak gen ifadeleri kontrollere kıyasla azalmıştır. Bu veriler qRT-PCR ile doğrulanmıştır. Biyoassay ve LC-MS/MS analizleriyle S. clavuligerus ΔadpA'da yabanıl suşa kıyasla daha yüksek tunikamisin üretimi gerçekleştiği S. clavuligerus pSPGAdpA'da ise tunikamisin titresinin azaldığı belirlenmiştir. CA biyosentetik gen kümesinde, S. clavuligerus ∆adpA'da kontrole kıyasla argR, oat2, oppA1, orf14, orf16, gcaS, pbp2, orf20 ve orf21'nin ifadeleri azalırken ceaS2, pah2 ve pbpA'nın ifadeleri artmıştır. Ayrıca, S. clavuligerus ∆adpA'da CA üretimi kontrole kıyasla daha azdır. CephC gen kümesinde ise mutantta yabanıl suşa kıyasla pbpA, cmcT, pcd, cefE, cefD, cefF, cmcI, cmcJ, ccaR ve cmcH genlerinin ifadeleri artarken orf10, lat, pcbAB, pcbC ve pbpR'nin ifadeleri azalmıştır. Spesifik CephC üretimi S. clavuligerus ∆adpA'da özellikle T96 olmak üzere tüm saatlerde en yüksek CephC titresindedir. rAdpA'nın tunA geninin yukarı akış dizisine bağlandığı EMSA ile tespit edilmiştir. Ayrıca, RT-PCR çalışmalarıyla S. clavuligerus'da tunikamisin gen kümesinin çoğunlukla polisistronik transkriptler halinde transkribe oldukları gösterilmiştir. Çalışmamız S. clavuligerus'ta AdpA'nın antibiyotik biyosentezi ve global regülasyondaki rolünü detaylı bir şekilde sunmaktadır. Ayrıca, tunikamisin gen kümesinin transkripsiyonel organizasyonu ve de AdpA'nın bu gen kümesine doğrudan bağlanarak tunikamisin biyosentezi üzerindeki negatif regülasyon rolü ilk kez ortaya koyulmuştur.
Özet (Çeviri)
Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) is producer of numerous important secondary metabolites including tunicamycin, cephamycin C (CephC), and clavulanic acid (CA). In this study, using RNA-seq analysis, the effect of AdpA pleiotropic regulator on antibiotic biosynthesis and production in S. clavuligerus was investigated for the first time. RNA-seq analysis of TYD cultures (T48) of adpA gene-deleted mutant (S. clavuligerus ΔadpA), wild-type (S. clavuligerus NRRL 3585), recombinant strain containing multiple copies of adpA gene (S. clavuligerus pSPGadpA), and vector control (S. clavuligerus pSPG) revealed that differences in gene expressions clustered on global regulatory mechanisms, metabolic pathways, secondary metabolite and antibiotic biosynthesis pathways, membrane transport, and signal transduction categories. In tunicamycin biosynthetic gene cluster, expressions of tunABCDEH, and tunF, tunG, and tunL genes were higher in the mutant compared to the wild-type, whereas overall gene expressions in S. clavuligerus pSPGadpA were lower compared to controls. These data were also confirmed by qRT-PCR. Additionally, higher tunicamycin production in S. clavuligerus ΔadpA compared to the wild-type, while tunicamycin titer decreased in S. clavuligerus pSPGAdpA as shown by bioassay and LC-MS/MS analyses. In CA biosynthetic gene cluster, argR, oat2, oppA1, orf14, orf16, gcaS, pbp2, orf20, and orf21 expressions were reduced, but expressions of ceaS2, pah2, and pbpA were increased in the mutant compared to the control. Correspondingly, CA production in S. clavuligerus ΔadpA was lower than in the control. In CephC gene cluster, pbpA, cmcT, pcd, cefE, cefD, cefF, cmcI, cmcJ, ccaR, and cmcH expressions increased, while expressions of orf10, lat, pcbAB, pcbC, and pbpR decreased in the mutant compared to wild-type. Specific CephC production was highest in S. clavuligerus ΔadpA particularly at T96. EMSA revealed that rAdpA binds to the upstream sequence of tunA gene. Additionally, RT-PCR studies showed that tunicamycin gene cluster in S. clavuligerus are mostly transcribed as polycistronic transcripts. Our study presents the role of AdpA in antibiotic biosynthesis and global regulation in S. clavuligerus in detail. Additionally, the transcriptional organization of the tunicamycin gene cluster and the role of AdpA in directly binding to this gene cluster to negatively regulate tunicamycin biosynthesis have been demonstrated for the first time.
Benzer Tezler
- Comparative transcriptome analyses of a standard strain and clavulanic acid overproducing industrial strain of s. Clavuligerus
S. Clavulirus'un standart bir suşu ile klavulanik asiti çok yüksek miktarda üreten bir endüstriyel suş arasında karşılaştırmalı transkriptom analizi
GÖZDE ÇELİK
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON
- Streptomyces Clavuligerus'ta lysa geninin çoklu ifadesi ve sefamisin c biyosentezi üzerine etkisi
Effect on cephamycin c biosynthesis and multiple expression of lysa gene in Streptomyces Clavuligerus
ÇİĞDEM OTUR
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
- Streptomyces clavuligerus'ta demir regülasyonu ve sekonder metabolit üretimi arasındaki ilişkinin belirlenmesi
Determination of interaction between iron regulation and secondary metabolite production in Streptomyces clavuligerus
BÜŞRA ABANOZ SEÇGİN
Doktora
Türkçe
2024
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
- BldG ve CcaR regülatör proteinlerinin Streptomyces clavuligerus'ta tunikamisin biyosentezi üzerine etkileri
The effects of BldG and CcaR regulatory proteins in tunicamycin biosynthesis in Streptomyces clavuligerus
LOKMAN BAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
- Targeted disruption of Homoserine dehydrogenase gene in Streptomyces clavuligerus and its effects on cephamycin C production
Streptomyces clavuligerus'da homoserin dehidrogenaz geninin hedeflenmiş blokasyonu ve bunun sefamisin C üretimi üzerine etkileri
AYŞE KOCA ÇAYDAŞI
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
Y.DOÇ.DR. EBRU İNCE YILMAZ