Development of recombinant antibiotics against Enterococcus faecium
Enterococcus faecium'a karşı rekombinant antibiyotik geliştirilmesi
- Tez No: 889593
- Danışmanlar: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji, Biotechnology, Infectious Diseases and Clinical Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 101
Özet
Amaç: E. faecium'un sahip olduğu beta laktamlara düşük afinite gösteren PBP5 proteinine karşı recombinant antibiyotik geliştirilmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: PBP5 proteininin çözünür formunu kodlayan gen pET-30a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı, rekombinant olarak üretildi ve IMAC ile saflaştırıldı. Cd-1 fareleri saf sol-PBP5 proteini ile immunize edildi ve ELISA ile doğrulandı. İmmünize farelerden RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve VH amplifikasyonu yapıldı. VH amplikonları pComb3-hy fajmidine klonlanarak VH gösteren faj kütüphanesi oluşturuldu. Sol-PBP5'e bağlanan fajlar biopanning yöntemiyle seçildi ve VH sekansları belirlendi. VH43'ün 3 boyutlu yapısı ve sol-PBP5 ile interaksiyonu modellendi. VH43 klonlandı ve rekombinant olarak üretildi. BOCILLIN-FL kullanılarak karşılaştırmalı bağlanma testi yapıldı. VH43'ün antibakteriyel etkisi tek başına ve sefalosporin ile kombine edilerek test edildi. İstatistiksel analizde bağımsız örneklemler için t-testi, tek yönlü varyans analizi ve Tukey's HSD testleri kullanıldı. Bulgular: sol-PBP5'in pET-30a(+) vektörüne klonlandığı koloni PCR ve sekans analizi ile doğrulandı. sol-PBP5 proteininin ekspresyonu ve saflaştırıldığı SDS-PAGE analizinde yaklaşık 75 kDa boyutunda bant görülmesiyle doğrulandı. Proteinin BOCILLIN-FL ile muamelesi sonucunda SDS-PAGE analizinde parlama görüldü. Saf sol-PBP5 ve PBS ile enjeksiyon sonrasında, sol-PBP5 ile kontrol grubu arasında anlamlı antikor yanıtı görülmesi ile doğrulandı (p-değeri = 9.02e-05). İmmünize farelerden izole edilen izole edilen total RNA'dan izole edilen cDNA agaroz jelde yaklaşık 500-600 boyunda bant verdi. cDNA'den çoğaltılan VH amplikonları fajmid vektörüne klonlandı ve koloni PCR ile doğrulandı. Faj kütüphanesinden sol-PBP5'e afinite gösterenler biopanning ile seçildi ve biopanning öncesi ve sonrası arasında faj sayısında beklenen düşüş gözlendi. 3. Biopanning döngüsü sonrasında afinite gösteren fajın kodladığı VH sekanslandı. VH43'e ait amino asit sekansı ve bulundurduğu CDR sekansları belirlendi. Keşfedilen VH43'ün moleküler ağırlığı 10.3 kDa ve proteinin yapısında 12 alfa heliks ve 61 beta zincir bulunduğu ortaya kondu. VH43 ve sol-PBP5 arasında 7 hidrojen bağı oluştuğu ve bağların lokasyonları belirlendi. VH43 rekombinant protein olarak ekspresyonunda üretildi ve N ve C terminalindeki Histag ile birlikte toplamda 20.3 kDa olduğu SDS-PAGE analizi ile gösterildi. VH43 ve VH kodlayan fajların sol-PBP5'e bağlandığı BOCILLIN FL ile yapılan karşılaştırılmalı bağlanma deneyinde parlaklığın azalması ile kanıtlandı. VH43 tek başına antibakteriyel etki göstermemiştir, ancak ceftazidime/cefazoline ile kombinlendiğinde, ceftazidime/cefazoline tek başına uygulandığında göre önemli bir inhibitör etkiye sahip olmuştur. Bu, VH43 ve ceftazidime'nin sinerjik etkisini doğrulamaktadır. Sonuç: Antibiyotik dirençli E. faecium suşlarının artışı, yeni moleküllerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Bu tez çalışmasında keşfedilen VH43 E. faecium'a karşı geliştirilen ve sekansı tespit edilen ilk antikor/antikor fragmentidir. VH43'ün sefazolin/seftazidim ile kombine halde uygulandığında E. faecium'un büyümesini önlemesi onun recombinant antibiyotik potansiyelini ortaya koymuştur.
Özet (Çeviri)
Purpose: It was aimed to develop a recombinant antibiotic originating from the VH sequence of antibodies obtained from PBP5-immunized mice Materials and Methods: The gene encoding soluble PBP5 was cloned into the pET-30a(+) vector, produced recombinantly, and purified by IMAC. CD-1 mice were immunized with sol-PBP5, and the immune response was confirmed by ELISA. RNA from immunized mice spleens was used for cDNA synthesis and VH amplification. A VH-displaying phage library was created by cloning VH amplicons into pComb3-hy phagemid. Phages binding to sol-PBP5 were selected via biopanning, and their VH sequences were identified. The 3D structure of VH43 and its interaction with sol-PBP5 were modeled, and VH43 was produced recombinantly. Binding tests were performed with BOCILLIN-FL. Synergistic effects of VH43 with cephalosporin were tested using bacterial growth analysis and modified Kirby-Bauer/spot tests. Results: Cloning of sol-PBP5 into the pET-30a(+) vector was confirmed by sequence analysis. Expression and purification were validated via SDS-PAGE, with BOCILLIN-FL treatment confirming the protein's native conformation. Immunization was confirmed by ELISA (p-value = 9.02e-05). cDNA from total RNA of immunized mice spleens showed 500-600 bp bands on agarose gel. VH amplicons were cloned into the phagemid, and a phage library was produced via M13K07 infection. Affinity phages for sol-PBP5 were selected by biopanning, and VH sequences were determined after the third biopanning cycle. VH43's amino acid sequence and CDRs were identified, with a molecular weight of 10.3 kDa, 12 alpha helices, and 61 beta chains. Seven hydrogen bonds were found between VH43 and sol-PBP5. Recombinant VH43, confirmed via SDS-PAGE to be 20.3 kDa including His-tags, showed reduced brightness in BOCILLIN FL binding experiments. Combining VH43 with cephalosporin significantly inhibited bacterial growth, with increased zone diameter in modified Kirby-Bauer tests compared to cephalosporin alone. Conclusion: The increase in antibiotic-resistant E. faecium strains requires the development of new molecules. VH43 discovered in this thesis study is the first antibody/antibody fragment developed against E. faecium and whose sequence was determined. Combining recombinant VH43 with cephalosporin showed synergetic effect and significantly inhibited bacterial growth. This result underscores the potential of VH43 to enhance the effectiveness of cephalosporins that are normally ineffective, offering a promising approach for combating bacterial infections.
Benzer Tezler
- Sortaz A enzimine karşı inhibitör peptitlerin geliştirilmesi
Developing of inhibitor peptides against sortase A enzyme
MÜCAHİDE KÖKSAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. FAHRİYE CEYDA DUDAK ŞEKER
- Rekombinant transmembran proteinlerin kromatografik yöntemlerle saflaştırılması
Purification of recombinant transmembrane proteins with chromatographic techniques
LEVENT TURA
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MURAT TOPUZOĞULLARI
DOÇ. DR. TÜLİN ÖZBEK
- Development of methods for the production and analysis of novel recombinant proteins with potential anti-infective properties
Potansiyel anti-enfektif özellikleri olan yeni rekombinant proteinlerin üretimi ve analizi için yöntemlerin geliştirilmesi
AMİNE YÜCEKUL
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyokimyaKonya Gıda ve Tarım ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ GÜLCİHAN GÜLSEREN
- AROA defektif mutant salmonella ınfantıs elde edilmesi ve karakterizasyonu
Achieve and characterization of AROA defective mutant salmonella infantis
İNCİ BAŞAK KAYA
Doktora
Türkçe
2017
Veteriner HekimliğiAnkara ÜniversitesiMikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAKAN YARDIMCI
- İmplant kaynaklı enfeksiyon etkeni olan staphylococcus epidermidis'e özgü aptamer geliştirilmesi ve aptamerin biyofilm oluşumuna etkisinin in vitro koşullarda incelenmesi
Development of specific aptamer for staphylococcus epidermidis which causes implant related infections and in vitro investigation of aptamer's effect on biofilm formation
EMİNE ALTUN
Doktora
Türkçe
2022
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜLYA YAVUZ ERSAN
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR