Geri Dön

Investigation of structural differences between wild-type and mutant forms of mutsα by molecular dynamics simulations

Mutsα heterodimerinin yabanıl tip ve mutant formları arasındaki yapısal farklılıklarının moleküler dinamik simülasyonları ile incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 883313
  2. Yazar: CLARA XAZAL BURAN
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. MERT GÜR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 75

Özet

Kanser, günümüzde kardiyovasküler rahatsızlıklardan sonra en çok ölüme neden olan hastalık türü olmuştur. Kanser türleri içerisinde ise ülkemizde ve dünyada oldukça sık görülen kolon kanseri insan sağlığını tehlikeye atmaktadır. Herediter Non-Polipozis Kolorektal Kanser (HNPCC), kalıtsal bir kolon kanseri türüdür ve tüm klorektal kanserlerin %3-5'ini oluşturmaktadır. HNPCC ile ilişkilendirilen birkaç protein bulunmaktadır. Bu proteinler, DNA onarım mekanizmalarında görev alan ve DNA'da oluşan hataların giderilmesinde görev almaktadır. Yapılan çalışmalar, DNA'daki lezyonların onarımından sorumlu olan proteinlerde meydana gelen mutasyonların, proteinlerin doğru çalışmasını engelleyerek hücrede mutasyonların birikmesine neden olduğunu ve hücrelerin kanser hücresine dönüşmesine yol açtığını göstermiştir. Bu çalışmaların amacı, kolon kanseri ile ilişkilendirilen MutSα protein kompleksinde meydana gelen bazı mutasyonların proteinin yapısında ve dinamiğinde meydana getirdiği değişimleri tespit etmektir. Moleküler Dinamik (MD) Simülasyonları, proteinlerin yapıları ve işlevlerindeki değişimleri gözlemleyebilme olanağı sağlayarak protein dinamiği ile ilgili önemli bilgiler vermektedir. Hesaplamalı yöntemler, deneysel teknikler kullanılarak elde edilemeyen atomik seviyede enerjetik, yapısal ve dinamik bilgiler sunması nedeniyle son yıllarda oldukça dikkat çeken bir alan olmuştur. Bu çalışmada, hesaplamalı ve teorik yöntemler kullanılarak MutSα protein kompleksinde meydana gelen mutasyonların protein yapı ve dinamiğine etkileri analiz edilmiştir. Çeşitli eksojen ve endojen etkenler genoma zarar vererek hasarlı DNA'ya neden olmaktadırlar. Genomik stabilizasyon sonucunda meydana gelebilecek DNA hasarları, kodladıkları proteinlerin hatalı olmasına ve hücrenin işleyişinin aksamasına neden olarak kanser hücrelerine ya da hücre ölümüne neden olabilmektedir. Hücreler, hasarlı DNA'yı düzeltebilmek ve hücrenin temel işleyişindeki aksamaları engellemek amacıyla çeşitli DNA tamir sistemleri geliştirmişerdir. Bu tamir sistemleri, meydana gelen DNA lezyonlarının çeşitlerine ve büyüklüklerine göre hasarlı DNA'ya müdahale ederek hasarın giderilmesini sağlamaktadırlar. Yanlış eşleşme tamiri (İngilizcesi Mismatch Repair, MMR), DNA tamir sistemlerinden biridir. Bu sistem, replikasyon sırasında polimerazların hata düzeltme (İngilizcesi proofreading) etkinliğinden kaçan yanlış baz eşleşmelerinin düzeltilmesinde ve polimeraz kayması nedeniyle tekrarlayan DNA dizilerinin replikasyonunda ortaya çıkabilen ekleme/silme döngülerinin (İngilizcesi insertion/deletion loop, IDL) onarımında görevlidir. MMR, MutS ve MutL protein kompleksleri tarafından gerçekleştirilmektedir. Uyumsuzluk tanıma adımıyla başlayan MMR sisteminde iki heterodimer protein kompleksi görev almaktadır. MutSα heterodimeri, baz-baz uyumsuzluklarının ve küçük IDL'lerin tanınmasını sağlarken MutSβ heterodimeri, daha büyük IDL'lerin tanınmasında görev alır. MutSα, MSH2 ve MSH6 genlerinin kodladığı aynı isimli proteinlerin dimer olarak bulunduğu kompleks yapıya verilen isimdir. MutSα, DNA üzerinde hareket ederek yanlış eşleşmiş bazları tanır ve bu bölgeye bağlanarak DNA tamirini başlatır. MutSα'da meydana gelen bazı mutasyonlar kanser çalışmaları ile ilişkilendirilmiştir. Bu kompleks proteinin üzerinde meydana gelen belirli mutasyonlar, proteinin işlevinin gerçekleşmesini engelleyerek hücrede mutasyonların birikmesine ve sonucunda kansere neden olmaktadır. Bu proteinde meydana gelen mutasyonların sadece bir kısmı kanser ile ilişkilendirilmiş ancak patojenik varyasyon olarak tanımlanan bazı mutasyonların protein etkinliği üzerindeki etkisi henüz kesin bilinmemektedir. MutSα kompleksini oluşturan MSH2 ve MSH6 proteinleri beş ana bölgeye ayrılmıştır: yanlış eşleşme bağlanma bölgesi, bağlayıcı bölge, kol bölgesi, kıskaç bölgesi ve ATPaz bölgesi. Bu bölgeler her iki monomerde de bulunan ve benzer görevleri gerçekleştiren yapılardır. Yanlış eşleşme bağlanma bölgesi, DNA'da bulunan yanlış eşleşen bazları tanıyan ve bu bazlara bağlanmanın gerçekleştiği bölgedir. Bağlayıcı bölge allosterik sinyalleşmeden sorumluyken kol bölgesinin ise yanlış eşleşme bölgesi ile ATPaz bölgesi arasında sinyal iletiminden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Kıskaç bölgesi DNA omurgası ile etkileşerek ve bağ yaparak DNA'yı stabilize eder. ATPaz bölgesi, ATP hidrolizi yaparak proteinin DNA boyunca hareket etmesi için gerekli enerjinin elde edildiği bölgedir. Bu domainleri içeren MSH2 ve MSH6 proteinlerinin bir araya gelmesiyle oluşan MutSα kompleksi DNA üzerinde taramalar yaparak yanlış eşleşmeleri tanıyıp bu bölgelere bağlanır, DNA tamirinden sorumlu olan diğer proteinlerin de bu bölgeye gelerek hatanın boyutuna bağlı olarak hasar tamiri ya da programlı hücre ölümünün (apoptozis) yolunu açar. Sağlıklı bir hücrede DNA tamiri mekanizmaları sorunsuz çalışarak DNA hasarları tamir edilir, tamir edilemeyecek boyuttaki hasar olması durumda apoptozis gerçekleşir. Ancak DNA tamir mekanizması içerisindeki proteinlerde meydana gelen mutasyonlar DNA tamir mekanizmasının doğru çalışmasını engelleyerek hücrede hasarlı/mutant DNA'ların birikmesine ve tümör hücrelerine ve erken yaşlanmayla sonuçlanabilecek metabolik süreçlere neden olmaktadır. Yapılan çalışmalar DNA yanlış eşleşme tamiri proteinlerinden olan MutSα'da meydana gelen spesifik mutasyonların kalıtsal olabildiğini ve kansere neden olduğunu ortaya koymuştur. Kalıtsal kolon kanserine neden olan varyasyonların patojenitesine bakılması amacıyla yapılan çoklu gen testleri sonucunda tespit edilen varyantların patojenisitesi ile ilgili olarak sonuçlara varılmaya çalışılmaktadır. Bazı varyantların patojenisitesi tam olarak tayin edilemediğinden bu varyantlar klinik önemi belirsiz varyant (İngilizcesi variant of uncertain significance, VUS) olarak isimlendirilmektedir. Prof. Dr. Levent Doğanay ve grubunun yapmış olduğu çalışmada ailesinde kolon kanseri öyküsü bulunan bireylerden alınan örnekler ile yapılan genetik tarama testleri sonucunda elde edilen Ala733Thr, Arg577Cys ve Ser1279Asn VUS'ları çalışma grubumuza bildirilmiştir. Bu mutasyonların DNA'sız MutSα'ya olan etkileri tüm atom Moleküler Dinamik (MD) simülasyonları yapılarak incelenmiştir. Bu mutasyonların protein işlevinde meydana getirebileceği değişimlere bakmak üzere öncelikle, MutSα proteininin MD simülasyonları için PDB ID: 2O8B numaralı yapılar kullanılarak DNA'ya bağlı olmayan sistemler hazırlanmıştır. Yabanıl tip ve mutant proteinler için simülasyon sonuçlarını karşılaştırabilmek üzere her yapı için iki replika sistem oluşturulmuştur. Proteinler için sistem hazırlanırken hücrede bulundukları fizyolojik ortam ve koşullar dikkate alınarak gerekli iyon konsantrasyonu sağlanmıştır. Yapılar, su kutusunda çözdürüldükten sonra kısa minimizasyon ve denge simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Dengeye gelen yapılar her replika için 200 ns boyunca simüle edilmiştir. Yabanıl tip ve üç adet mutant protein için ikişer replika simülasyon yürütülmüş ve toplamda 1600 ns uzunluğunda MD simülasyonu gerçekleştirilmiştir. Simülasyon sonuçları ile kök ortalama kare sapması (RMSD), kök ortalama kare dalgalanması (RMSF), ısı kapasitesi, etkileşim analizi ve temel bileşenler analizi (PCA) gerçekleştirilmiştir. RMSD analizi, simülasyonun dengeye gelip gelmediği ve konformasyon değişikliği olup olmadığı hakkında bilgi vermektedir. RMSD ortalamalarına bakıldığında mutant proteinlerin RMSD değerlerinin yabanıl tip proteine göre daha yüksek olduğu bu nedenle mutasyonların protein konformasyonunda bir miktar değişime neden olabileceği düşünülmüştür. Ancak replikalar arasındaki RMSD değerlerine bakıldığında bazı yapıların henüz dengeye gelmediği görülmüştür. RMSF analizi, yapısal esneklik, hareketlilik ve termal stabilite ile ilgili çıkarımlar yapabilmek için kullanılmaktadır. Çalışmada beş bölge için ayrı ayrı dalgalanmalara bakılmıştır. Yabanıl tip protein ile kıyaslandığında mutant proteinlerde genel olarak daha yüksek dalgalanma olduğu görülmüştür. Mutasyonların bulunduğu bölge itibariyle doğrudan etkilemeyeceği bölgelerde meydana gelen dalgalanma hareketi, mutasyonların protein dinamiğinde meydana getirdiği değişimlerin farklı bölgelerde ortaya çıktığını da göstermektedir. Yabanıl tipe göre en çok dalgalanmanın görüldüğü bölge kıskaç bölgesi olmuştur. Bu bölge için simülasyon başında ve sonundaki değişime bakıldığında mutasyonun gerçekleştirği proteinlerin kıskaç bölgererinin mutasyondan etkilenmiş olduğu sonucuna varılmıştır. Isı kapasitesi, proteinin termodinamik özellikleri ile ilgili bilgi verebilmektedir. Analiz sonucu elde edilen bulgular, tüm mutant yapıların ısı kapasitesinin yabanıl tip proteine göre daha yüksek olduğunu ortaya koymakta ve proteinin termodinamik özelliklerinin farklılaşmış olabileceğini göstermektedir. Bu sonuçlar, mutasyonların proteinin açılması yönünde etkisi olabileceğini düşündürmektedir. Etkileşim analizi sonucunda mutant yapıların yabanıl tip proteine kıyasla hidrojen bağı ve tuz köprüsü etkileşimlerinde değişimler olduğu gözlemlenmiştir. Yabanıl tipte sıklıkla gözlemlenen etkileşimlerin bazıları kaybolurken yabanıl tipte gözlemlenmeyen yeni etkileşimler kurulduğu da görülmüştür. PCA analizi ile protein içideki en baskın iki hareket elde edilmiş ve bunların proteinin hangi bölgelerinde etkili olduğu gözlemlenmiştir. Proteindeki en baskın hareket MSH2 proteini üzerinde görülmüş ve protein üzerinde döndürme etkisi olabileceği düşünülmüştür. MSH6 proteini üzerinde ise en baskın ikinci hareket etkilidir. Bu hareket çoğunlukla kıskaç bölgelerinde etkili olmuş ve kıskacın dışarı yönünlü hareketini etkilediği düşünülmüştür. Ayrıca serbest enerji yüzeyinde proteinlerin MD simülasyonları boyunca uzayda örnekledikleri bölgeler gösterilmiştir. Bu çalışmada, DNA'ya bağlı olmayan MutSα proteininde meydana gelen mutasyonların protein yapı ve dinamiğine etkileri incelenmiş ve mutant yapıların yabanıl tipe göre daha farklı termodinamik ve yapısal özellikler gösterdiği sonucuna varılmıştır.

Özet (Çeviri)

Cancer is the most common cause of death after cardiovascular diseases. Among the cancer types, colon cancer, which is very common in our country and the world, endangers human health. The aim of the studies in this thesis is to determine the changes in the structure and dynamics of the MutSα protein due to mutations in the protein complex associated with colon cancer. Molecular Dynamics (MD) Simulations provide important information about protein dynamics by providing the opportunity to observe changes in the structures and functions of proteins. Computational methods have been a remarkable field in recent years because they provide energetic, structural and dynamic information at the atomic level that cannot be obtained using experimental techniques. In this study, the effects of mutations in MutSα on protein structure and dynamics were analyzed using computational and theoretical methods. MutSα complex, formed by the MSH2-MSH6 heterodimer is responsible for the recognition and repair of mismatches. Some mutations in MutSα have been associated with cancer studies. Certain mutations that occur on protein complex cause the accumulation of mutations in the cell and eventually causing cancer. Only some of the mutations in protein complex have been associated with cancer, but the effect of some mutations, defined as pathogenic variation, on protein activity is not yet known. The MSH2 and MSH6 proteins that make up the MutSα complex are divided into five major regions: the mismatch binding domain, the connector domain, the lever domain, the clamp region, and ATPase domain. The mismatch binding domain recognizes mismatched bases and binds to these bases. The connector domain is responsible for allosteric signaling, while the lever region is thought to be responsible for signaling between the mismatch binding domain and the ATPase domain. The clamp domain stabilizes the DNA by interacting and bonding with the DNA backbone. The ATPase domain is the region where the energy required for the protein to move along the DNA is obtained by hydrolysis of ATP. MutSα complex detects mismatches by scanning the DNA and binds to mismatch region to start repair mechanisms. In a healthy cell, DNA repair mechanisms work smoothly, DNA damages are repaired, and apoptosis occurs in case of irreparable damage. However, mutations in the proteins in the DNA repair mechanism prevent the correct functioning of the DNA repair mechanism, causing the accumulation of damaged/mutant DNA in the cell and causing tumor cells. Studies have revealed that specific mutations in MutSα, one of the DNA mismatch repair proteins, can be hereditary and cause cancer. Some mutations obtained as a result of genetic screening tests by Prof. Dr. Levent Doğanay and his research group, with samples taken from individuals with a family history of colon cancer have been reported to our study group. Ala733Thr, Arg577Cys and Ser127Asn mutations were detected, and the effects of these mutations on MutSα without DNA were investigated by performing all-atom MD simulations. In order to look at the changes that these mutations may cause in protein function, first of all, systems were prepared for the MD simulations of the MutSα protein using structures with PDB ID: 2O8B. Two replica systems were created for each construct to compare the simulation results for wild-type and mutant proteins. While simulating the proteins, the required ion concentration was provided by considering the cell's physiological conditions. After the structures were dissolved in water, short minimization and equilibrium simulations were performed. The equilibrated structures were simulated for 200ns. Two replicate simulations were carried out for wild-type and three mutant proteins, and totaling 1600ns MD simulations were performed. Root-mean-square deviation (RMSD), root-mean-square fluctuation (RMSF), heat capacity, interaction analysis and principal components analysis (PCA) were performed to investigate the effect of the mutations on the MutSα complex. The RMSD analysis gives information about whether the simulation has reached equilibrium and whether there has been a conformational change. The average RMSD values of mutant proteins were higher than the wild-type protein. Therefore, these mutations resulted in changes in protein conformation and dynamics. RMSF analysis is used to provide insight about structural flexibility, mobility and thermal stability. In this thesis, fluctuations were investigated for five domains separately and it was observed that the mutant proteins had similar or higher fluctuations than the wild-type protein in general. For the wild-type, the region with the highest fluctuations was observed to be the clamp region. Heat capacity can provide information about the thermodynamic properties of the protein. The findings obtained as a result of the analysis showed higher heat capacities for all mutants compared to that of the WT protein and show that the thermodynamic properties of the protein may have been differentiated. As a result of the interaction analysis, it was observed that the mutants had changes in hydrogen bond and salt bridge interactions compared to the WT protein. With PCA analysis, the two most dominant movements in the protein were obtained. Conformations were projected onto principal components and based on the conformational space sampled by the proteins during the MD simulations heat map surfaces were constructed. In this study, the effects of mutations in the DNA-free MutSα protein structure and dynamics were investigated and it was concluded that mutant structures showed different thermodynamic and structural properties compared to wild-type.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    401193

    Investigation of structural and functional properties of the betaine transporter BetP from Corynebacterium glutamicum by using infrared spectroscopy

    Başlık çevirisi yok

    GÜNNUR GÜLER

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Fizik ve Fizik MühendisliğiJohann-Wolfgang-Goethe-Universität

    PROF. DR. WERNER MANTELE

  2. Tez No

    879718

    Molecular and functional investigation of disease-associated cytoskeletal proteins protrudin and MYO1H

    Hastalık ilişkili sitoskeletal proteinler protrudin ve MYO1H'nin moleküler ve fonksiyonel araştırılması

    ECE SELÇUK ŞAHİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ

  3. Tez No

    718174

    In vitro and in silico investigation of NFIB-SUMO interactions

    NFIB-SUMO etkileşimlerinin in vitro ve in silico olarak incelenmesi

    AYBERK ÖZKAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR

  4. Tez No

    470684

    Computational investigation of protein dynamics based on energy dissipation

    Proteın dinamiği üzerine enerji dağılımına dayalı hesapsal araştırma

    ELİF NAZ BİNGÖL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyomühendislikMarmara Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. PEMRA ÖZBEK SARICA

  5. Tez No

    535873

    Investigation of the effects of the bag-1 – hsc70/hsp70 interaction on the bag-1 complexes in erad mechanism and ubiquitin/proteasome system

    Bag-1 – hsc70/hsp70 etkileşiminin erad yolağı ve ubikitin/proteazom sistemindeki bag-1 komplekslerine olan etkisinin incelenmesi

    EZGİ BAŞTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyofizikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. GİZEM DİNLER DOĞANAY

Geri Dön