Memeli süspanse HEK293F hücrelerinde aşı adayı toxoplasma gondiirekombinant GRA1 ve ROP6 proteinlerinin ekspresyonu ve saflaştırılması
Expression and purification of vaccine candidate toxoplasma gondiirecombinant GRA1 and ROP6 proteins in mammalian suspension HEK293Fcells
- Tez No: 914928
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AYSU DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Biyoteknoloji, Parazitoloji, Genetics, Biotechnology, Parasitology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Aşı Çalışmaları Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Aşı Çalışmaları Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Dünya çapında yaklaşık 3,5 milyar insanın, yaygınlığı coğrafi, iklimsel ve sosyoekonomik koşullara bağlı olarak değişen oranlarda Toxoplasma gondii adlı parazitin neden olduğu toksoplazmozisten etkilendiği tahmin edilmektedir. Ciddi klinik tablo ve ekonomik kayıplara yol açan toksoplazmozisis tedavisinde halen kullanılabilir %100 etkili bir ilaç olmadığı için T. gondii'ye karşı hem insan hem de hayvanlarda kullanılmak üzere etkin ve koruyucu bir aşıya ihtiyaç duyulmaktadır. Henüz toksoplazmozise karşı bu özellikte güvenli ve etkin bir aşı bulunmamaktadır. Döşkaya ve arkadaşlarının 2018 yılında yaptığı çalışmada protein microarray tarama ile T. gondii'ye ait 2870'ten fazla ekzon ürününün antijenik potansiyeli araştırılmıştır. Tarama sonucunda bunların içinden 240 protein, aşı adayı olarak ortaya çıkmıştır. Bu aşı adayı proteinlerin içinde ROP6 ve GRA1 proteinleri insan ve fare antikor profillerinde yüksek immünite göstermiş olup aşı adayı olarak umut verici olduğu öngörülmüştür. Son yıllarda rekombinant proteinlerin üretimi yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için temel bir araç haline geldi, ancak aynı zamanda terapötik ve biyoteknolojik uygulamaların geliştirilmesi için de temel olarak kabul edildi. Bu nedenle bu proteinlerin ekspresyonunun, saflaştırılmasının optimizasyonu için yenilikçi çalışmalara ve yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Bu tezin amacı, T. gondii'nin her üç döneminde de var olan, insan ve fare antikor profillerinde yüksek immünojen olduğu gösterilmiş aşı adayı GRA1 ve ROP6 proteinlerini literatürde ilk defa insan kaynaklı süspanse memeli HEK293F hücrelerinde eksprese etmek ve ileri kromatografik yöntemler ile saflaştırarak, rekombinant protein üretim biyoproseslerine katkıda bulunmaktır. Araştırmada kullanılan yöntemlerde hem biyoinformatik analizler gerçekleştirilirken hem de ıslak laboratuvar ortamında protein ekspresyonu ve saflaştırma çalışmaları ile kapsamlı bir süreç izlendi. Bu amaçla öncelikle T. gondii'nin immünojenik GRA1 ve ROP6 proteinleri biyoinformatik araçlarla analiz edildi. In silico analizler sırasında proteinlerin aminoasit dizileri, transmembran kısımları, antijenik epitop bölgeleri ve çözünürlükleri incelendi. Epitop analizi ile MHC-I, MHC-II ve B hücre epitopları, immün yanıtı uyarma potansiyeli açısından değerlendirildi. GRA1 ve ROP6 proteinlerini kodlayan genler, insan hücrelerinde ekspresyon için kodon optimize edilerek pcDNA3.4 ve pcDNA3.1 vektörlerine eklenmek üzere tasarlandı. Biyoinformatik analiz aşamalarından sonra laboratuvar ortamında ekspresyon ve saflaştırma süreçleri gerçekleştirildi. Bunun için süspanse HEK293F hücreleri kullanılarak hücre hatları oluşturuldu. Sonrasında pcDNA3.4-GRA1 ve pcDNA3.1- ROP6 vektörleri HEK293F hücrelerine transfekte edildi ve proteinlerin ekspresyonu gerçekleştirildi. Eksprese edilen proteinlerin saflaştırma işlemleri için afinite kromatografisi kullanıldı. Saflaştırılan proteinlerin saflık ve moleküler büyüklükleri SDS-PAGE ve Western blot ile analiz edildikten sonra Bradford yöntemi ile protein konsantrasyonu belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre T. gondii rekombinant GRA1 proteininin memeli HEK293F hücrelerinde ekspresyona uygun olduğu ve hücre kültürü üst sıvıdan saflaştırılarak aşı çalışmalarında yeterli konsantrasyonda saf olarak üretilebileceği gösterilmiştir. Sonraki araştırmalarla saflaştırılan rekombinant GRA1 proteininin immünojenisitesinin ayrıntılı şekilde incelenmesi hedeflenmiştir. Anahtar Kelimeler; Toxoplasma gondii; Rekombinant protein; GRA1; ROP6; HEK293; İnsan Embriyonik Böbrek Hücresi 293; Aşı; Süspanse memeli hücre kültürü
Özet (Çeviri)
It is estimated that approximately 3.5 billion people worldwide are affected by toxoplasmosis caused by the parasite Toxoplasma gondii, with prevalence rates varying depending on geographical, climatic and socioeconomic conditions. Since there is currently no 100% effective drug available for the treatment of toxoplasmosis, which causes serious clinical conditions and economic losses, an effective and protective vaccine is needed for use in both humans and animals against T. gondii. There is no safe and effective vaccine against toxoplasmosis with this feature yet. In the study conducted by Döşkaya et al. in 2018, the antigenic potential of more than 2870 exon products belonging to T. gondii was investigated with protein microarray screening. As a result of the screening, 240 proteins emerged as vaccine candidates. Among these vaccine candidate proteins, ROP6 and GRA1 proteins showed high immunity in human and mouse antibody profiles and were predicted to be promising as vaccine candidates. In recent years, the production of recombinant proteins has become a fundamental tool for structural, biochemical and biophysical studies, but it has also been accepted as fundamental for the development of therapeutic and biotechnological applications. Therefore, innovative studies and approaches are needed to optimize the expression and purification of these proteins. The aim of this thesis is to express the vaccine candidate recombinant GRA1 and ROP6 proteins, which are present in all three periods of T. gondii and have been shown to be highly immunogenic in human and mouse antibody profiles, in human-derived suspension mammalian HEK293F cells for the first time in the literature, and to contribute to the production processes of vaccine candidate recombinant GRA1 and ROP6 proteins by developing a purification method with advanced chromatographic methods. The methods used in the research followed a comprehensive process with both bioinformatics and in vitro protein expression and purification studies. First, the target protein was determined, then the immunogenic GRA1 and ROP6 proteins of T. gondii were analyzed with bioinformatics tools. Protein amino acid sequences, transmembrane helices, antigenic properties and solubility were examined with In silico analysis. Non-antigenic regions were removed during design to increase solubility. Epitope analysis evaluated MHC-I, MHC-II and B cell epitopes for their potential to trigger immune responses. Encoding genes of GRA1 and ROP6 protein were codon optimized for expression in human cells and designed to be added to pcDNA3.4 and pcDNA 3.1 vectors. Expression and purification process was performed in laboratory environment after bioinformatics stages. Cell lines were created using suspended HEK293F cells. Using commercial transfection kit, pcDNA3.4-GRA1 and pcDNA3.1-ROP6 vectors were transfected into HEK293F cells and small-scale production of the proteins was performed. After the purity and molecular size of the purified proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis, protein concentration was determined by Bradford method. According to the results obtained, it has been shown that T. gondii recombinant GRA1 protein is suitable for expression in mammalian HEK293F cells, can be purified from cell culture supernatant in sufficient concentration for vaccine studies. Further studies are aimed to investigate the immunogenicity of the purified recombinant GRA1 protein in detail. Keywords; Toxoplasma gondii; Recombinant protein; GRA1; ROP6; Human Embryonic Kidney 293; HEK293; Vaccine; Suspended mammalian cell culture;
Benzer Tezler
- CHO hücrelerinde monoklonal antikor üretimi sırasında XBP-1(s) aşırı ekspresyonunun er stres ve glikozilasyon arasındaki ilişkiye etkisinin tanımlanması
Identification of effect of overexpression XBP-1(s) on relationship between er stress and glycosylation during monoclonal antibody production in CHO cells
PELİN KOLÇAK YAŞLI
Doktora
Türkçe
2024
BiyoteknolojiAnkara ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EVREN DORUK ENGİN
- Hayvansal hücre/hücresel ürün üretimi için sıcaklık duyarlı mikrotaşıyıcıların sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of thermoresponsive microcarriers for the production of animal cells/cellular products
HEDİYE ÖZGEN TİMUÇİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
- Kitozan mikrokürelerden DNA serbestleşmesinin in vitro koşullarda incelenmesi
The investigation of DNA release from chitosan microspheres in vitro conditions
TUĞÇE DAŞTAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2003
Eczacılık ve FarmakolojiMarmara ÜniversitesiFarmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. KADİR TURAN
- Engineering and systematic comparison of constitutive promoters in various lines of chinese hamster ovary cells
Konstitütif promotörlerin mühendisliği ve çeşitli çin hamsteri yumurtalik hücre hatlarinda sistematik karşilaştirmasi
YAĞMUR TOKTAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ŞERİF ŞENTÜRK
- Depolanabilir tarım ürünlerindeki lepidopter ve coleopter zararlılarına karşı bacıllus thurıngıensıs içerikli biyopestisit geliştirilmesi
Development of a bacillus thuringiensis-based biopesticide against lepidopteran and coleopteran pests in stored agricultural products
İSLAM YILDIZ