Geri Dön

Probiyotiklerden yeni bir biyoaktif molekülün izolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and characterization of a new bioactive molecule from probiotics

PDF İndir

  1. Tez No: 921001
  2. Yazar: AURELE ADOUWODJI ASSOU KOFFI
  3. Danışmanlar: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA, DOÇ. DR. NAZMİYE ÖZLEM ŞANLI
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Mikrobiyoloji, Biology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 105

Özet

Doğadaki ve özellikle fermente gıdalardaki sağlığa yararlı mikrooganizmalar olarak tanımlanan probiyotikler, infeksiyon, oksidatif stres, inflamasyon, kanser gelişimi gibi patolojik süreçleri durduracak ya da yavaşlatacak çeşitli metabolitler üretirler. Probiyotikler ve ürettikleri antimikrobiyal peptidler (AMP'ler), özellikle günümüzün en önemli sağlık sorunlarından biri olan antibiyotiğe dirençli patojenlere karşı bir çözüm getirebilir. Bu çalışmada, geleneksel fermente içeceklerden (Boza, Kefir ve Şalgam) izole edilmiş 10 probiyotik suş (Lactobacillus fermentum B4, Lactobacillus fermentum B6, Lactobacillus parabuchneri B25, Lactobacillus fermentum K13, Lactobacillus plantarum K14, Lactobacillus plantarum K15, Gluconobacter frateurii K26, Lactococcus lactis S2, Lactobacillus pentosus S5 ve Lactobacillus plantarum S8) ile topraktan izole edilmiş 2 probiyotik suş (Weisella paramesenteroides L3 ve Enterococcus hirae Y7) antimikrobiyal aktiviteleri bakımından incelendi. Enterococcus hirae Y7 suşu, hem hücresel hem de hücre dışı düzeyde, sırasıyla agar spot ve agar kuyu difüzyon testlerinde 3 patojenik enterokoka (E. hirae ATCC 10541, VRE E. faecium ATCC 700221 ve VRE E. faecalis ATCC 51299) karşı dikkat çekici bir antibakteriyel aktivite gösterdi. Bu nedenle, bu suşun hücresiz süpernatantı (Y7CFS) ile biyoaktivite rehberli fraksiyonlama çalışmaları yürütüldü. Aktif metabolitleri tanımlamak için ilk aşamada protein çöktürmesi yapıldı. Y7CFS, amonyum sülfat ile işleme sokularak protein içeren (Y7CFS-P) ve içermeyen (Y7CFS-NP) fraksiyonlar elde edildi ve bu fraksiyonlarla antibakteriyel aktivite testleri yürütüldü. Bu testler sonucunda etkin fraksiyonun protein içeren Y7CFS-P fraksiyonu olduğu belirlendi. Tripsinle işleme sokulan Y7CFS'nin aktivitesini kaybetmesi, antibakteriyel aktiviteden sorumlu bileşenin (poli)peptid yapıda olduğunu doğruladı. Y7CFS'deki biyoaktiviteden organik asitlerin ve H2O2'nin sorumlu olmadığı, sırasıyla nötralizasyon ve katalaz uygulamasıyla gösterildi. Daha sonra Y7CFS-P'deki peptidler, RP-HPLC yöntemiyle kromatografik olarak 4 alt fraksiyona ayrıldı ve her fraksiyonun antibakteriyel aktivitesi incelendi. Ancak alt fraksiyonların hiçbiri antibakteriyel aktivite göstermedi. Bu durumun kromatografik ayırım sırasında aktif bileşenin kaybedilmesinden, alt fraksiyondaki konsantrasyonunun düşük olmasından, aktif üç boyutlu yapısını kaybetmesinden veya yıkılmasından kaynaklanmış olabileceği gibi, aktivitenin karışımdaki peptidlerin sinerjik etkisiyle ortaya çıkmış olabileceği değerlendirildi. Y7CFS-P'nin daha önce tanımlanmış bir peptid içermediği, LC-MS peptid haritalama yöntemiyle ortaya koyuldu Bu bulgu, antibakteriyel aktivitenin peptid yapıda yeni bir molekül ile ilişkili olduğunu gösterdi. Y7CFS-P'de molekül ağırlığı 14-60 kDa arasında değişen en az 5 polipeptidin bulunduğu SDS-PAGE analiziyle ortaya koyuldu. Çalışmanın son aşamasında, Y7CFS ile antioksidan aktivite testleri ve Y7CFS-P ile antikanser ve anti-inflamatuar aktivite testleri gerçekleştirildi. In vitro antioksidan aktivite testleri (DPPH ve CUPRAC testleri) sonucunda, Y7CFS'nin radikal süpürme aktivitesinin bulunmadığı; bakır indirgeme kapasitesinin ise dikkate alınmayacak kadar düşük olduğu belirlendi. Y7CFS-P'nin gastrik kanser hücreleri (AGS hücre hattı) üzerindeki antikanser aktivitesi, 250 µg/mL konsantrasyondan başlayarak konsantrasyona ve tedavi süresine bağlı olarak arttı. Bununla birlikte, bu aktivite büyük ölçüde içerdiği besiyerinden (MRS) türevlenen peptidlerden kaynaklandı ve sitotoksik dozlar sağlıklı hücreler (insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK 293) için de toksikti. İnflamasyonun LPS ile indüklendiği fare makrofaj hücrelerinde (J774), 50 µg/mL Y7CFS-P fraksiyonu ile yürütülen anti-inflamatuar aktivite testleri, bu örneğin pro-inflamatuar aracılar IL-1β, IL6, iNOS, 5-LOX ve COX-2'nin gen ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığını, anti-inflamatuar sitokin IL-4'ün gen ekspresyonunu ise artırdığını ortaya koydu. Sonuç olarak, probiyotik Enterococcus hirae Y7 suşunun patojen enterokoklara karşı antibakteriyel aktivite gösteren, ayrıca anti-inflamatuar etkinliğe sahip (poli)peptid yapıda yeni molekül(ler) içerdiği ilk kez bu tezde ortaya koyuldu. Bu çalışmada incelenen Enterococcus hirae Y7 probiyotiğinin biyoaktif peptidlerinden, daha ileri saflaştırma ve yapı aydınlatması çalışmaları, farmakokinetik analizler, güvenlik testleri, hayvan deneyleri ve klinik çalışmalar sonrasında patojen enterokoklara ve/veya inflamasyona karşı mücadele edebilecek ürünlerin geliştirilebileceği öngörülmektedir.

Özet (Çeviri)

Probiotics, defined as microorganisms beneficial to health in nature and especially in fermented foods, produce various metabolites that can stop or slow down pathological processes such as infection, oxidative stress, inflammation, and cancer development. Probiotics and their antimicrobial peptides (AMPs) can provide a solution to antibiotic-resistant pathogens, one of the most important health problems of our time. In this study, 10 probiotic strains (Lactobacillus fermentum B4, Lactobacillus fermentum B6, Lactobacillus parabuchneri B25, Lactobacillus fermentum K13, Lactobacillus plantarum K14, Lactobacillus plantarum K15, Gluconobacter frateurii K26, Lactococcus lactis S2, Lactobacillus pentosus S5 and Lactobacillus plantarum S8) isolated from traditional fermented beverages (Boza, Kefir and Şalgam), and 2 probiotic strains isolated from soil (Weisella paramesenteroides L3 and Enterococcus hirae Y7) were examined for their antimicrobial activities. Enterococcus hirae Y7 strain showed remarkable antibacterial activity against 3 pathogenic enterococci (E. hirae ATCC 10541, VRE E. faecium ATCC 700221 ve VRE E. faecalis ATCC 51299) at both cellular and extracellular levels in agar spot and agar well diffusion tests, respectively. Therefore, bioactivity-guided fractionation studies were conducted with Y7CFS, the cell-free supernatant of this strain. Protein precipitation was performed in the first step to identify active metabolites. Y7CFS was treated with ammonium sulphate to obtain protein-containing (Y7CFS-P) and protein-free (Y7CFS-NP) fractions, and antibacterial activity tests were carried out with these fractions. As a result of these tests, it was determined that the effective fraction was the protein-containing Y7CFS-P fraction. The loss of activity of Y7CFS treated with trypsin confirmed that the component responsible for antibacterial activity has a (poly)peptide structure. Organic acids and H2O2 were not responsible for the bioactivity in Y7CFS, which was shown by neutralization and catalase treatment, respectively. The peptides in Y7CFS-P were then chromatographically separated into 4 subfractions by RP-HPLC method and the antibacterial activity of each fraction was analysed. However, none of the subfractions showed antibacterial activity. It was evaluated that this situation may be due to the loss of the active ingredient during chromatographic separation, its low concentration in the sub-fraction, loss of its active three-dimensional structure or destruction, or the activity may have emerged due to the synergistic effect of the peptides in the mixture. LC-MS peptide mapping revealed that Y7CFS-P did not contain a previously identified peptide. This finding indicated that the antibacterial activity was related to a new molecule with a peptide structure. SDS-PAGE analysis revealed that Y7CFS-P contained at least 5 polypeptides with molecular weight ranging between 14-60 kDa. In the final stage of the study, antioxidant activity tests with Y7CFS and anticancer and anti-inflammatory activity tests with Y7CFS-P were performed. As a result of in vitro antioxidant activity tests (DPPH and CUPRAC tests), it was determined that Y7CFS did not have radical scavenging activity and its copper ion reducing capacity was negligible. The anticancer activity of Y7CFS-P on gastric cancer cells (AGS cell line) increased in a concentration- and treatment time-dependent manner, starting from a concentration of 250 µg/mL. However, this activity was largely due to the peptides derived from the medium (MRS) it contained, and cytotoxic doses were also toxic to healthy cells (human embryonic kidney cell line HEK 293). Anti-inflammatory activity tests conducted with 50 µg/mL Y7CFS-P fraction in LPS-induced mouse macrophage cells (J774) revealed that this sample significantly down-regulated the gene expression of pro-inflammatory mediators IL-1β, IL6, iNOS, 5-LOX and COX-2, while up-regulating the gene expression of the anti-inflammatory cytokine IL-4. In conclusion, it was demonstrated for the first time in this thesis that the probiotic Enterococcus hirae Y7 strain contains new molecule(s) in (poly)peptide structure with antibacterial activity against pathogenic enterococci and anti-inflammatory activity. It is predicted that products that can fight against pathogenic enterococci and/or inflammation can be developed from the bioactive peptides of Enterococcus hirae Y7 probiotic examined in this study after further purification and structure elucidation studies, pharmacokinetic analyses, safety tests, animal experiments and clinical studies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    905981

    Molecular and biochemical characterization of human originated Lactobacillus reuteri

    İnsan kaynaklı Lactobacillus reuteri'nin moleküler ve biyokimyasal karakterizasyonu

    SAIF KAREEM MANSOOR JUMAILI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyolojiBolu Abant İzzet Baysal Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    382571

    Tahıl bazlı fermente sinbiyotik instant karışım: Tatlı denemeleri

    Cereal-based fermented synbiotic instant blend: Dessert practises

    ÖZLEM KARAGÜL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    Gıda MühendisliğiEge Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEDEF NEHİR EL

  3. Tez No

    900078

    Piyasada satılan probiyotik içerikli ürünlerin yeni nesil dizileme ile mikrobiyolojik kalitesinin belirlenmesi

    Determination of microbiological quality of commercially available probiotic-containing products by next-generation sequencing

    SELÇUK AHMET ALGINGİL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Gıda Mühendisliğiİstanbul Aydın Üniversitesi

    Gıda Güvenliği Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ AYLA ÜNVER ALÇAY

  4. Tez No

    902986

    Development of a probiotic beverage (synbiotic) from different edible wild fruits fortified with Gum Arabic

    Farklı yenilebilir yabani meyvelerden Gum Arabik ile güçlendirilmiş probiyotik içecek (sinbiyotik)üretimi

    HAGER HASSAN ALI BABEKER

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Gıda MühendisliğiBursa Uludağ Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARZU AKPINAR BAYİZİT

  5. Tez No

    353783

    Investigating phenolic content, antioxidant activity and bioavailability of raw/steam cooked buckwheat, black chickpea and brown lentil

    Pişmemiş ve buharda pişirilmiş kara buğday, kara nohut ve kahverengi mercimeğin fenolik madde, antioksidan aktivitesi ve biyoyararlılıklarının incelenmesi

    BENGİ ECE YALÇIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. DİLARA ERDİL

Geri Dön