Geri Dön

Farklı klı̇nı̇k kaynaklardan ı̇zole edı̇len Klebsıella pneumonıae'nın çekirdek algılayıcı genlerı̇nı̇n moleküler tespı̇tı̇

Molecular detection of core sensing genes of Klebsiella pneumoniae isolated from different clinical sources

PDF İndir

  1. Tez No: 921627
  2. Yazar: MOHAMMED ALI MOHAMMED AL-BADRI
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MELDA DÖLARSLAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Çankırı Karatekin Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 120

Özet

Klebsiella pneumoniae önemli bir patojenik Gram-negatif, motil olmayan bakteridir. Bakteri, sağlıklı insanların burun boşluğunda, boğazında, gastrointestinal sisteminde ve cildinde asemptomatik olarak barınabilen fırsatçı bir patojen olarak kabul edilir. İdrar yolu enfeksiyonları (İYE), pnömoni, bakteriyemi, pürülan karaciğer apseleri ve yara enfeksiyonları dahil olmak üzere birçok yaygın hastalıktan sorumludur. Bu çalışmanın amacı, farklı klinik kaynaklardan izole edilen çoklu ilaç dirençli Klebsiella pneumoniae bakterilerinin izolasyonu ve karakterizasyonu, biyofilm ve quorum sensing genlerinin tespiti ve gümüş nanopartiküllerin bu genlerin gen ekspresyonları üzerindeki etkisini incelemektir. Çalışma Eylül 2021-Eylül 2022 tarihleri arasında yürütülmüştür. Balgam, idrar ve yara kaynaklarından izole edilen 150 klinik Klebsiella pneumoniae suşu, MacConkey agar besiyerinde 37℃'de 24 saat boyunca kültürlenmiştir. İzolatı tanımlamak ve antibiyotik duyarlılığını tespit etmek için VITEK-2 kompakt sistemleri kullanılmıştır. Biyofilm oluşturma yeteneği 96 kuyulu mikroplaka yöntemi ile belirlenmiştir. Çekirdek algılama geni (LuxS), biyofilm oluşturma geni (mrkD), Efflux geni (AcrAB), Hızlı Amplifiye Polimorfik DNA (RAPD) Analizi ve Enterobakteriyel Tekrarlayan İntergenik Konsensüs (ERIC) Analizi genlerinin varlığı ve ekspresyonu için değerlendirme PCR ve RT-PCR ile yapılmıştır. Gümüş nanopartiküllerin toksisitesi bir hemoliz deneyi ile test edilmiştir. Klebsiella pneumoniae klinik suşları balgamın %50'sinden, idrarın %43,33'ünden ve yaraların %6.66'sından izole edilmiştir. Suşlar Genişlemiş spektrumlu beta laktamazlara (GSBL) %77, Gentamisin'e %67, Sulfametoksazol/Trimetoprim'e %65, Amoksisilin-klavulanik aside %55, Ampicillin %39, Cefotaxime %39, Ceftazidime %39, Cefixime %36, Piperacillin/Tazobactam %33, Meropenem %29, Ciprofloxacin %29, Imipenem %13 ve Amikacin %13 direnç göstermiştir. Tüm suşlar biyofilm oluşturabilmiş, toplam 150 izolattan %13'ünün güçlü biyofilm üreticisi, %40'ının orta düzeyde biyofilm üreticisi ve %47'sinin zayıf biyofilm üreticisi olduğu görülmüştür. Nükleik asit konsantrasyonu ve saflık sonuçları Qubit florometre kullanılarak belirlenmiştir. Analiz edilen örnekler 20 güçlü biyofilm üreticisi izolattan, 20 orta derecede biyofilm üreticisi izolattan ve 20 zayıf biyofilm üreticisi izolattan elde edilen DNA ve RNA'yı içermektedir. Nükleik asitlerin ortalama konsantrasyonları (21,95±1,30), (15,16±1,55), (23,33±3,23) olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, nükleik asitlerin saflığı 260nm/280nm'deki spektrofotometrik emilim oranı olarak hesaplanmış ve üç biyofilm üreten kategori için (1,85±0,08), (1,92±0,02), (1,90±0,02) olarak ortaya çıkmıştır. RAPD PCR, üç gruptan rastgele ve eşit olarak seçilen otuz örneğin DNA düzeyinde genetik polimorfizmin belirlenmesine adanmıştır, mevcut çalışmada RAPD analizini gerçekleştirmek için OP-V02, OP-V09, OP-V14, OP-V19 ve OP-V04 olmak üzere beş primer kullanılmıştır. Belirli bir primer ile PCR amplifikasyonu ve elde edilen amplifikasyon bantlarının elektroforezinden sonra, sonuçlar bandın varlığını gösteren (+) ve bandın yokluğu anlamına gelen (-) olarak belirlenmiştir. ERIC PCR için üç gruptan rastgele ve eşit olarak otuz örnek seçilmiştir. ERIC profilleri Dice benzerlik matrisi katsayısı kullanılarak karşılaştırılmış ve filogenetik ağacı hazırlamak için komşu-birleştirme yöntemiyle kümelenmiştir. ERIC bantlama paternlerinde iki veya daha fazla farklı banda sahip izolatlar farklı ERIC tipleri olarak kabul edilmiştir. Dendrogram kümelere göre çizilmiştir. ERIC-PCR, her bir güçlü biyofilm üreticisi K. pneumoniae izolatı için 175 ile 4000 bp arasında değişen boyutlarda bantlar içeren farklı bant desenleri oluşturmuştur. İzolat başına bant sayısı 3 ile 11 arasında değişmekte olup, bu durum izolatlar arasında önemli genetik çeşitlilik olduğunu göstermektedir. Orta derecede biyofilm üreticisi K. pneumoniae izolatlarında bant boyutu 175-2500 bp arasında değişmektedir. İzolat başına bant sayısı 3 ile 11 arasında değişmektedir ve bu da izolatlar arasında önemli genetik çeşitlilik olduğunu göstermektedir. Son olarak, çoğaltılan bantların boyutu 175 ile 4000 bp arasında değişmiştir. İzolat başına bant sayısı 4 ile 10 arasında değişmektedir; bu da zayıf biyofilm üreticisi K. pneumoniae için güçlü ve orta derecede biyofilm üreticisi izolatlara kıyasla daha az çeşitli bir genetik tabloya işaret etmektedir. Nanopartikül uygulamasının quorum sensing (LuxS) ve biyofilm oluşumunda rol oynayan (mrkD) genlerin ifade düzeyleri üzerindeki etkisini belirlemek için gerçek zamanlı bir PCR deneyi uygulanmıştır. Bu çalışmanın sonucu, LuxS geninin nanopartiküllerle muamele edilmeden önceki ortalama ∆∆ değerinin (0,142±0,46), aynı genin nanopartiküllerle muamele edildikten sonraki ortalama ∆∆ değerinden (0.102±0.68) istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediğini (p=0,61); aynı genin nanopartiküllerle muamele öncesi ve sonrası kat değişimleri karşılaştırıldığında da aynı karşılaştırmanın istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediğini (p=0,133) ortaya koymuştur. Bu çalışmanın sonucu, mrkD geninin nanopartiküllerin uygulanmasından önceki ortalama ∆∆ değerinin (0,68±0,23), aynı genin nanopartiküllerle muameleden sonraki değerinden (-0,03±0,34) istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde (p=0,063) farklı olmadığını ortaya koymuştur. Ancak, aynı genin nanopartiküllere maruz kalmadan önceki ve sonraki kat değişimleri karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p=0,049) görülmüştür. Gümüş nanopartiküllerin toksisitesi bir hemoliz deneyi ile test edilmiştir. Hemolizin eşlik ettiği 500 mg/mL gümüş nanopartikül çözeltisi %0,033 olarak ortaya çıkmıştır; bu da gümüş nanopartiküllerin hemolitik olmadığı ve biyouyumlu olduğu anlamına gelmektedir. Bu çalışma Klebsiella pneumoniae klinik izolatlarının antibiyotik direnci ve biyofilm oluşturma yetenekleri hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. GSBL'ler %77, Gentamisin %67 ve Sulfametoksazol/Trimetoprim %65 olmak üzere yüksek direnç oranları gözlenmiştir. Meropenem (%29) ve Imipenem (%13) gibi karbapenemlere karşı direnç de kaydedilmiş olup, bu durum tedavideki zorlukları vurgulamaktadır. Tüm izolatlar biyofilm oluşturmuş olup, %13'ü güçlü üretici, %40'ı orta düzeyde üretici ve %47'si zayıf üretici olarak patojenin kalıcılığını ve virülansını vurgulamaktadır. RAPD ve ERIC-PCR analizleri, izolatlar arasında, özellikle de güçlü ve orta derecede biyofilm üreticilerinde önemli genetik çeşitlilik olduğunu ortaya koymuştur. Gümüş nanopartiküller biyofilmle ilişkili mrkD geninin ekspresyonunu azaltmada istatistiksel olarak anlamlı bir etki gösterirken LuxS gen ekspresyonu etkilenmemiştir. Nanopartiküller biyouyumludur ve test edilen konsantrasyonda ihmal edilebilir hemoliz sergilemektedir. Bu çalışma, çoklu ilaca dirençli K. pneumoniae'nin oluşturduğu halk sağlığı tehdidinin ve gümüş nanopartiküllerin biyofilmle ilişkili virülansı azaltmak için yardımcı bir strateji olarak potansiyelinin altını çizmektedir

Özet (Çeviri)

Klebsiella pneumoniae is an important pathogenic Gram-negative, non-motile bacterium. The bacterium is considered an opportunistic pathogen that can harbor asymptomatically in the nasal cavity, throat, gastrointestinal tract and skin of healthy people. It is responsible for many common diseases, including urinary tract infections (UTIs), pneumonia, bacteremia, purulent liver abscesses and wound infections. The aim of this study was to isolate and characterize multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae bacteria isolated from different clinical sources, to detect biofilm and quorum sensing genes and to study the effect of silver nanoparticles on gene expression of these genes. The study was conducted between September 2021 and September 2022. A total of 150 clinical Klebsiella pneumoniae strains isolated from sputum, urine and wound sources were cultured on MacConkey agar medium at 37℃ for 24 hours. VITEK-2 compact systems were used to identify the isolate and determine antibiotic susceptibility. Biofilm forming ability was determined by 96-well microplate method. Evaluation for the presence and expression of the quorum sensing gene (LuxS), biofilm formation gene (mrkD), Efflux gene (AcrAB), Rapid Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Analysis and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) Analysis genes was performed by PCR and RT-PCR. The toxicity of silver nanoparticles was tested by a hemolysis assay. Clinical strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from 50% of sputum, 43.33% of urine and 6.66% of wounds. The strains were resistant to Extended spectrum beta lactamases (ESBL) 77%, Gentamicin 67%, Sulfamethoxazole/Trimethoprim 65%, Amoxicillin-clavulanic acid 55%, Ampicillin 39%, Cefotaxime 39%, Ceftazidime 39%, Cefixime 36%, Piperacillin/Tazobactam 33%, Meropenem 29%, Ciprofloxacin 29%, Imipenem 13% and Amikacin 13%. All strains were able to form biofilms, 13% of the total 150 isolates were strong biofilm producers, 40% were moderate biofilm producers and 47% were weak biofilm producers. Nucleic acid concentration and purity results were determined using a Qubit fluorometer. The analyzed samples contained DNA and RNA from 20 strong biofilm producer isolates, 20 moderate biofilm producer isolates and 20 weak biofilm producer isolates. The mean concentrations of nucleic acids were calculated as (21.95±1.30), (15.16±1.55), (23.33±3.23). Furthermore, the purity of the nucleic acids was calculated as the spectrophotometric absorption ratio at 260 nm/280 nm and was (1.85±0.08), (1.92±0.02), (1.90±0.02) for the three biofilm producing categories. RAPD PCR was dedicated to the determination of genetic polymorphism at the DNA level of thirty samples randomly and equally selected from the three groups, five primers, OP-V02, OP-V09, OP-V14, OP-V19 and OP-V04, were used to perform RAPD analysis in the present study. After PCR amplification with a specific primer and electrophoresis of the amplification bands obtained, the results were designated as (+), indicating the presence of the band, and (-), meaning the absence of the band. Thirty samples were randomly and equally selected from the three groups for ERIC PCR. ERIC profiles were compared using the Dice similarity matrix coefficient and clustered by the neighbor-joining method to prepare the phylogenetic tree. Isolates with two or more different bands in ERIC banding patterns were considered as different ERIC types. The dendrogram was drawn according to clusters. ERIC-PCR generated different banding patterns for each strong biofilm-producing K. pneumoniae isolate, with bands ranging in size from 175 to 4000 bp. The number of bands per isolate ranged from 3 to 11, indicating significant genetic diversity among the isolates. In K. pneumoniae isolates, which are moderate biofilm producers, the band size ranged between 175-2500 bp. The number of bands per isolate ranged from 3 to 11, indicating significant genetic diversity among isolates. Finally, the size of the amplified bands ranged from 175 to 4000 bp. The number of bands per isolate ranged from 4 to 10, indicating a less diverse genetic picture for weak biofilm producer K. pneumoniae compared to strong and moderate biofilm producer isolates. A real-time PCR assay was performed to determine the effect of nanoparticle treatment on the expression levels of genes involved in quorum sensing (LuxS) and biofilm formation (mrkD). The results of this study showed that the mean ∆∆ of the LuxS gene before treatment with nanoparticles (0.142±0.46) was not statistically significantly different from the mean ∆∆ of the same gene after treatment with nanoparticles (0.102±0.68) (p=0.961); when the fold changes of the same gene before and after treatment with nanoparticles were compared, the same comparison was not statistically significantly different (p=0.133). The results of this study revealed that the mean ∆∆ of the mrkD gene before nanoparticle treatment (0.68±0.23) was not statistically significantly different (p=0.063) from the value of the same gene after nanoparticle treatment (-0.03±0.34). However, a statistically significant difference (p=0.049) was observed when the fold changes of the same gene before and after exposure to nanoparticles were compared. The toxicity of silver nanoparticles was tested with a hemolysis assay. A 500 mg/mL solution of silver nanoparticles accompanied by hemolysis was 0.033%, which means that silver nanoparticles are non-hemolytic and biocompatible. This study provides valuable information about the antibiotic resistance and biofilm-forming ability of Klebsiella pneumoniae clinical isolates. High resistance rates were observed for ESBLs 77%, Gentamicin 67% and Sulfamethoxazole/Trimethoprim 65%. Resistance to carbapenems such as Meropenem (29%) and Imipenem (13%) was also recorded, emphasizing the difficulties in treatment. All isolates formed biofilms, with 13% being strong producers, 40% moderate producers and 47% weak producers, emphasizing the persistence and virulence of the pathogen. RAPD and ERIC-PCR analyses revealed significant genetic diversity among the isolates, especially in strong and moderate biofilm producers. Silver nanoparticles showed a statistically significant effect in reducing the expression of the biofilm-associated mrkD gene, while LuxS gene expression was not affected. The nanoparticles were biocompatible and exhibited negligible hemolysis at the concentration tested. This study highlights the public health threat posed by multidrug-resistant K. pneumoniae and the potential of silver nanoparticles as an adjunctive strategy to reduce biofilm-associated virulence

Benzer Tezler

  1. Tez No

    752114

    Geniş spektrumlu beta - laktamaz üreten klebsıella pneumonıae izolatlarının rep - PCR genomik parmak izi tekniği kullanılarak moleküler tiplendirilmesi

    Molecular typing of extended -spectrum beta-lactamase-producing klebsiella pneumonia isolates using rep-PCR genomic fingerprinting technique

    NIHAD SHAHADHA ABED ABED

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyomühendislikKırşehir Ahi Evran Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERGİN KARİPTAŞ

  2. Tez No

    165724

    Antimikrobik etkili katyonik peptitlerin mikroorganizmalar üzerine tek başlarına ve kombinasyon halindeki etkilerinin araştırılması

    In vitro activities of antimicrobial cationic peptides, alone and in combination with antibiotics against microorganisms

    SİBEL DÖŞLER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2005

    Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi

    Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. BÜLENT GÜRLER

  3. Tez No

    352215

    Farklı kaynaklardan izole edilen salmonella suşlarının bazı virülans faktörlerinin incelenmesi

    Investigation of some virulence factors of salmonella strains isolated from different sources

    ZAVEN AĞAY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN ERDEM

  4. Tez No

    753900

    Antibacterial activity of biosynthesized nanoparticles by pyocyanin pigment against biofilms formed Escherichia coli isolated from different clinical sources

    Farklı klinik kaynaklardan izole edilen Escherichia coli tarafından oluşturulan biyofilmlere karşı piyosiyanin pigmenti ile biyosentezlenen nanopartiküllerin antibakteriyel aktivitesi

    RUSUL MANSOOR ABED AL-GBURI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ YAŞAR KEMAL YAZGAN

    DR. ÖĞR. ÜYESİ LAİTH AHMAD YAAQOOB

  5. Tez No

    846157

    Virulence factors and antibiotic resistance properties of Pseudomonas aeruginosa isolated from different clinical sources

    Farklı klinik kaynaklardan izole edilen Pseudomonas aeruginosa'nın virülans faktörleri ve antibiyotik direnç özellikleri

    MUSTAFA ABBAS KHALEEL KHALEEL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEHRA CAN KARAHAN

    DR. ÖĞR. ÜYESİ IMAN TAJER ABDULLAH

Geri Dön