Fe3O4@PEI10kDa ile dekore edilmiş Komagataella phaffii tarafından üretilen Candida antarctica lipaz B kullanılarak biyodizel üretimi
Biodiesel production using candida antarctica lipase B produced by komagataella phaffii decorated with Fe3O4@PEI10kDa
- Tez No: 936392
- Danışmanlar: DOÇ. DR. YAĞMUR ÜNVER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 136
Özet
Amaç: Bu çalışmada, indüklenebilir AOX1 promotörü (PAOX1) ve yapısal GAP promotörü (PGAP)'ın kontrolü altında rekombinant Candida antarctica lipaz B'yi ifade eden Komagataella phaffii (Pichia pastoris) hücreleri elde edildikten sonra, rekombinant hücrelerin manyetik nanopartiküllerle dekore edilmesiyle hücre dışına salınan lipaz miktarını artırmak ve elde edilen rekombinant CalB (rCalB)'nin biyokatalizör olarak kullanılmasıyla ticari ve atık kızartma (ayçiçek) yağından biyodizel üretmek amaçlandı. Yöntem: Bu çalışmada, CalB geninin kodon optimizasyonu yapıldı ve optimize geni içeren pPICZαA-CalB satın alındı. Kodon optimize CalB geni, pGKBα'ya entegre edilerek pGKBα-CalB elde edildi. K. phaffii'nin protein disülfit izomeraz geni (Pdi), pGKB'ye entegre edilerek pGKB-PDI elde edildi. K. phaffii hücrelerine, elde edilen plazmit DNA'ların sıralı bir şekilde transfer edilmesiyle farklı gen kombinasyonlarına sahip rekombinant mayalar elde edildi. Elde edilen hücreler tarafından rCalB üretildi. Enzim aktivite tayini ve SDS-PAGE analizi yapıldı. Rekombinant K. phaffii hücrelerinin manyetik nanopartiküllerle dekorasyonu için Fe3O4@PEI10kDa MNP'ler sentezlendi ve karakterizasyonu yapıldı. En yüksek lipaz üretiminin gözlendiği hücreler MNP'ler ile dekore edildi. Ticari ve atık kızartma (ayçiçek) yağı kullanılarak biyodizel üretimi için optimizasyon deneyleri gerçekleştirildi ve gaz kromatografi analizi ile yağ asidi metil esteri (FAME) içeriği belirlendi. Bulgular: Kodon optimize edildikten sonra CalB geninin kodon adaptasyon indeksi %69'dan %87'ye yükseltildi. Rekombinant plazmitler K. phaffii hücrelerine transfer edilerek pGKB-PDI/X-33, pPICZαA-CalB/X-33, pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33 ve pGKBα-CalB+pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33 hücreleri elde edildi. Enzim aktivite tayini ve SDS-PAGE analizi sonuçlarına göre yaklaşık 34 kDa'lık rCalB'nin rekombinant hücrelerde başarıyla üretilerek hücre dışına salgılandığı gözlendi. En iyi üretimin Pdi genini içeren hücrelerde olduğu gözlendi. FTIR ve TEM analizleriyle Fe3O4 nanopartiküllerinin PEI ile modifiye edildiği ve yaklaşık 14-28 nm aralığında küresel yapıya sahip olduğu belirlendi. Dekore edilen maya hücreleri (pGKBα-CalB+pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33) SEM analizi ile doğrulandı. En yüksek lipaz aktivitesi, dekore edilen hücrelerin 48 saatlik inkübasyon grubunda gözlendi. Biyodizel üretimi için optimum değerler; metanol:yağ molar oranı; 4:1, reaksiyon sıcaklığı; 30 °C, enzim içeren kültür sıvısı; 8 ml (2,4 EÜ) ve reaksiyon süresi; ticari yağda 168 saat iken atık kızartma (ayçiçek) yağında 96 saat olarak belirlendi. GC-FID analizlerine göre, üretilen biyodizelin yüksek oranda C16 ve C18 yağ asidi metil esterleri içerdiği belirlendi. Sonuç: Bu tez çalışmasında, lipaz üreten K. phaffii hücreleri elde edildi. MNP'lerle dekore edilen hücreler tarafından üretilen rCalB'nin hücre dışına daha fazla salgılandığı görüldü. Elde edilen rCalB'nin transesterifikasyonu ile üretilen biyodizelin mevcut biyodizellere alternatif olabileceği görüldü.
Özet (Çeviri)
Purpose: In this study, after obtaining Komagataella phaffii (Pichia pastoris) cells expressing recombinant Candida antarctica lipase B under the control of inducible AOX1 promoter (PAOX1) and constitutive GAP promoter (PGAP), it was aimed to increase the amount of lipase released out of the cell by decorating the recombinant cells with magnetic nanoparticles and to produce biodiesel from commercial and waste frying (sunflower) oil by using the obtained recombinant CalB (rCalB) as a biocatalyst. Method: In this study, codon optimization of the CalB gene was performed and pPICZαA-CalB containing the optimized gene was purchased. The codon optimized CalB gene was integrated into pGKBα to obtain pGKBα-CalB. The protein disulfide isomerase gene (Pdi) of K. phaffii was integrated into pGKB to obtain pGKB-PDI. Recombinant yeasts with different gene combinations were obtained by sequential transfer of the obtained plasmid DNAs to K. phaffii cells. rCalB was produced by the obtained cells. Enzyme activity determination and SDS-PAGE analysis were performed. Fe3O4@PEI10kDa MNPs were synthesized and characterized for decoration of recombinant K. phaffii cells with magnetic nanoparticles. The cells with the highest lipase production were decorated with MNPs. Optimization experiments for biodiesel production using commercial and waste frying (sunflower) oil were carried out and fatty acid methyl ester (FAME) content was determined by gas chromatography analysis. Findings: After codon optimization, the codon adaptation index of the CalB gene was increased from 69% to 87%. Recombinant plasmids were transferred to K. phaffii cells to obtain pGKB-PDI/X-33, pPICZαA-CalB/X-33, pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33 and pGKBα-CalB+pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33 cells. According to the results of enzyme activity determination and SDS-PAGE analysis, it was observed that approximately 34 kDa rCalB was successfully produced in recombinant cells and secreted into the extracellular space. The best production was observed in cells containing the Pdi gene. FTIR and TEM analyses determined that Fe3O4 nanoparticles were modified with PEI and had a spherical structure in the range of approximately 14-28 nm. Decorated yeast cells (pGKBα-CalB+pPICZαA-CalB+pGKB-PDI/X-33) were confirmed by SEM analysis. The highest lipase activity was observed in the 48 h incubation group of decorated cells. The optimum values for biodiesel production were determined as methanol:oil molar ratio; 4:1, reaction temperature; 30 °C, enzyme-containing culture broth; 8 ml (2.4 EU) and reaction time; 168 h in commercial oil and 96 h in waste frying (sunflower) oil. According to GC-FID analyses, it was determined that the produced biodiesel contained high levels of C16 and C18 fatty acid methyl esters. Results: In this thesis study, lipase producing K. phaffii cells were obtained. It was observed that rCalB produced by cells decorated with MNPs was secreted more outside the cell. It was seen that biodiesel produced by transesterification of rCalB could be an alternative to existing biodiesels.
Benzer Tezler
- The preparation, characterization and catalytic studies of Fe3O4/L(1-5) and Fe3O4/L(1-5)/Pd(II) type particles containing Fe3O4 (iron-oxide) connected dioxime
Fe3O4 (demir oksit) bağlanmış dioksim içeren Fe3O4/L(1-5) ve Fe3O4/L(1-5)/Pd(II) tipi partiküllerin, karakterizasyonu ve katalitik çalışmalar
ESRA KAYA
- Fe3O4 katkılı demir-gallik asit metal organik kafes destekli paladyum katalizörünün geliştirilmesi ve Heck reaksiyonu uygulaması
The development of the magnetic metal-organic framework supported palladium catalyst and the application of Heck reaction
OLCAY SEVERGÜN
- FE3O4-ÇDKNT yapısının sentezlenmesi ve sulu çözeltilerden antibiyotik gideriminde kullanımının incelenmesi
Synthesis of FE3O4-MWCNT structure and investigating of use its in antibiotic removal from aqueous solutions
ÖZLEM ERDAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyomühendislikFırat ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ VEYİS SELEN
- Fe3O4@HA@Ag sentezi, yapısının incelenmesi ve tekstilde kullanımı
Fe3O4@HA@Ag synthesis, structural investigation and usage in textile
CUMALİ DEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Tekstil ve Tekstil MühendisliğiTekirdağ Namık Kemal ÜniversitesiTekstil Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYLİN YILDIZ
- Fe3O4/SiO2/PAM manyetik malzeme sentezi, adsorpsiyon ve elektrooksidasyon yöntemiyle atık sulardan organik ve inorganik maddelerin giderimi
Removal of organic and inorganic substances from wastewater by Fe3O4/SiO2/PAM magnetic material synthesis, adsorption and electrooxidation method
HUSEYN OSMAN