Characterisation of Escherichia coli fimbrial and autotransporter adhesins
Escherichia coli Türüne ait Fimbrial ve Autotransporter Tipi Adezinlerin Özelliklerinin Belirlenmesi
- Tez No: 942050
- Danışmanlar: PROF. DR. MARK SCHEMBRİ, DR. MİNH-DUY PHAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Mikrobiyoloji, Biochemistry, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Unıversıty Of Queensland
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Escherichia coli, Gram-negatif bir bakteri olup, zararsız bir kommensal mikroorganizmadan ciddi bağırsak içi ve dışı enfeksiyonlara neden olabilen bir patojene kadar uzanan geniş bir çeşitlilik sergilemektedir. Kommensal ve patojenik suşlar arasındaki farklılıkları belirleyen özelliklerden biri, yüzeylere tutunma, kolonize olma ve biyofilm oluşturma yeteneğidir. E. coli'de bu özellikler genellikle, ototransporter (AT) proteinleri ve chaperone-usher (CU) tipi fimbrialar dahil olmak üzere yüzeye yerleşik adezinler aracılığıyla gerçekleşir. Bu çalışma, YfaL adlı bir AT proteini ve iki CU tipi fimbria olan Yad ve S fimbrialarının karakterizasyonuna odaklanmıştır. AT proteinleri, genellikle E. coli'de adezyon ve biyofilm oluşumu ile ilişkilendirilen büyük bir dış membran protein ailesini oluşturur. 3. Bölümde, tamamen dizilenmiş 1378 E. coli genomundan oluşan seçilmiş bir veri kümesinde, 49 farklı AT proteinini kodlayan genlerin yaygınlığı belirlenmiştir. yfaL geni, bu suşların %98'inde bulunarak oldukça yaygın bir dağılım göstermiştir. YfaL, sıklıkla agregasyon ve biyofilm oluşumu ile ilişkilendirilen AIDA-I alt grubuna ait bir AT proteinidir; ancak işlevi henüz tam anlamıyla tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, YfaL üzerinde yoğunlaşılmış; in silico analizler ile YfaL filogenisi incelenmiş ve bu filogeniden seçilen üç farklı YfaL varyantı işlevsel özellikleri bakımından değerlendirilmiştir. Her bir YfaL varyantını kodlayan gen klonlanarak eksprese edilmiş; spesifik bir antikor ve floresan mikroskopi ile YfaL'in hücre yüzeyinde lokalize olduğu gösterilmiştir. Rekombinant hücrelerin farklı büyüme koşulları altında agregasyon ve biyofilm oluşturma kapasiteleri test edilmiştir. YfaL varyantlarının hiçbiri agregasyonu sağlamasa da, hepsi düşük besin içeriğine sahip (1/10 seyreltilmiş LB) ortamda büyütüldüklerinde biyofilm oluşumunu desteklemiştir. Bu biyofilm özelliğinin büyüme ortamına bağımlı olduğu görülmüş; zira LB veya M9 minimal besiyerinde biyofilm oluşumu gözlenmemiştir. Fimbrialar, E. coli ve birçok başka bakteri tarafından üretilen çok alt birimli organeller olup, adezyon ve biyofilm oluşumunda önemli rol oynar. E. coli'de fimbria oluşumu büyük oranda CU montaj yolakları ile gerçekleşir; bu türde şu anda tanımlanmış 38 farklı CU tipi fimbria bulunmaktadır. CU fimbrialar, majör ve minör alt birim proteinlerinin yanı sıra, periplazmik bir chaperon ve dış membran usher proteininden oluşur. 4. Bölümde, ağır akut piyelonefrit ve neonatal menenjite neden olabilen bağırsak dışı E. coli suşları ile sıklıkla ilişkili olan S fimbriaların işlevi incelenmiştir. Seçilmiş 1378 E. coli genomundan oluşan veri kümesinin analizi, S fimbrialarını kodlayan genlerin büyük oranda filogrup B2'ye ait suşlarda bulunduğunu ve S-fimbria pozitif suşların %95'inin bu gruba ait olduğunu göstermiştir. Bu fimbriaların işlevini araştırmak için fimbrial alt birim proteinlerine odaklanılmıştır. Önceki çalışmalar, S fimbriaların siyalik asit ile bağlandığını ve bu bağlanmanın ağırlıklı olarak SfaA (majör) ve SfaS (minör) alt birimleri tarafından gerçekleştiğini öne sürmüştür. Ancak bu bulgular, CU tipi fimbria yapısı ve işlevine dair güncel bilgilerle çelişmektedir. Bu nedenle, bu bağlanmanın ucunda bulunan SfaH adezini aracılığıyla gerçekleşip gerçekleşmediği araştırılmıştır. SfaA, SfaS, SfaH ve SfaG genleri klonlanmış; her bir protein denatüre olmayan koşullarda eksprese edilip saflaştırılmıştır. Önceki çalışmalarla tutarlı şekilde, SfaA proteini N-Asetil-D-glukozamin glikanına en yüksek bağlanma afinitesi göstermiştir; SfaS düşük bağlanma göstermiş, SfaG ve SfaH ise bağlanmamıştır. SfaH adezinine ait lektin bağlanma bölgesi saflaştırılmış ve glikan dizileri ile bağlanma özgüllüğü test edilmiştir. Toplamda, SfaH 40 farklı glikana bağlanmış; bunlar arasında kan grubu antijenleri, Lewis antijen yapıları, laktoz içeren yapılar ve GM2 yer almıştır. Ayrıca SfaH lektin bağlanma bölgesinin kristal yapısının belirlenmesi için kristalizasyon çalışmaları yapılmış, ancak yalnızca uzun, iğne benzeri kristaller elde edilmiş ve atomik çözünürlükte yapısal analiz gerçekleştirilememiştir. Yad fimbriaları olarak bilinen bir CU tipi fimbria, bağırsak epitel hücrelerine tutunmayı ve fare mesanesinde kolonizasyonu destekleyebildiği gösterilmiştir. Ancak bu fimbriaların işlevsel mekanizması tam olarak anlaşılmamıştır. 5. Bölümde, Yad fimbriaları hakkında bilgi derinleştirilmiş ve özellikle YadC uç adezin proteininin bağlanma özellikleri araştırılmıştır. İlk olarak, 1378 E. coli genomundan oluşan veri kümesinde Yad fimbrialarına ait genlerin dağılımı incelenmiştir. Yad fimbria genlerinin filogenetik gruplara göre değişken bir dağılım gösterdiği belirlenmiş; B2 grubundaki suşların %86'sında, buna karşılık A (%62), B1 (%65), C (%43), D (%1), E (%0) ve F (%19) gruplarında daha düşük oranda bulunmuştur. Yad fimbrialarının işlevsel özelliklerini araştırmak amacıyla YadC adezininde allelik varyasyon gösteren dört farklı gen kümesi klonlanmış ve rekombinant E. coli suşlarında eksprese edilmiştir. Ancak tekrar eden girişimlere rağmen bu fimbriaların ifadesi tutarsız olmuştur; yalnızca ST131 kökenli EC958 suşundan elde edilen gen kümesi ile yüzeyde fimbrial ekspresyon saptanabilmiştir. Bu nedenle, çalışmalar YadC uç adezin proteininin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonuna odaklanmıştır. FimH ve PapG gibi karakterize edilmiş diğer fimbrial adezinlerde olduğu gibi, YadC de N-terminal lektin bağlanma bölgesi ve C-terminal pilin bölgesi olmak üzere iki ayrı birimden oluşur. Lektin bağlanma bölgesinin belirli glikan reseptörlerine bağlanarak doku tropizmini sağladığı öngörülmüştür. Bu bölgeye karşılık gelen dizi PCR ile çoğaltılmış ve çeşitli ekspresyon vektörlerine klonlanmıştır. Bu yöntemle, iki farklı YadC alleline ait lektin bölgeleri denatüre olmayan koşullarda saflaştırılmıştır. Ne yazık ki, kristalizasyon girişimleri başarılı olmamış; yüksek çözünürlüklü yapısal analiz için uygun kristaller elde edilememiştir. Genel olarak, bu çalışma E. coli adezinlerinin yaygınlığına dair anlayışımızı derinleştirmiş; YfaL ve S fimbrialarının işlevleri ortaya konmuştur. Yad fimbrialarının işlevlerini araştırmaya yönelik yeni bir strateji önerilmiş; Yad fimbrialarının bakteriyel patogenezdeki rolünün daha fazla araştırılması gerekliliği ortaya konmuştur.
Özet (Çeviri)
Escherichia coli is a Gram-negative bacterium that exhibits extensive diversity, ranging from a harmless commensal to a pathogen capable of causing serious intestinal and extra-intestinal infections. One feature that drives differences between commensal and pathogenic strains is the capacity to adhere to and colonise surfaces and form biofilms. In E. coli, these properties are often mediated by surface-located adhesins, including autotransporter (AT) proteins and chaperone-usher (CU) fimbriae. This work focussed on the characterisation of the YfaL AT and two CU fimbriae, Yad and S fimbriae. ATs represent a large outer membrane protein family and frequently associated with E. coli adhesion and biofilm formation. In Chapter 3, we determined the prevalence of genes encoding 49 different AT proteins from a curated set of 1378 completely sequenced E. coli genomes. The yfaL gene was highly prevalent and found in 98% of strains in the dataset. YfaL belongs to the AIDA-I subgroup of AT proteins frequently associated with aggregation and biofilm formation, yet its function has not been properly characterised. Here, we focused on YfaL, and employed an in-silico analysis to examine the YfaL phylogeny. We also selected three representative YfaL variants from this phylogeny and evaluated their functional properties. The gene encoding each YfaL variant was cloned and expressed, demonstrating cell surface localization of YfaL using a specific antibody in combination with fluorescence microscopy. To illuminate functional characteristics of each variant, recombinant cells expressing YfaL were tested for aggregation and biofilm formation under different growth conditions. While none of the YfaL variants mediated aggregation, all variants promoted biofilm formation following growth in low-nutrient one-tenth diluted LB broth. Surprisingly, this biofilm feature was growth media dependent, as biofilms were not formed in LB broth or M9 minimal media. Fimbriae are multi-subunit organelles produced by E. coli and many other bacteria and play a significant role in adhesion and biofilm formation. The assembly of fimbriae on the E. coli surface is largely driven by the CU assembly pathway, with 38 different CU fimbriae currently defined in the E. coli species. CU fimbriae are comprised of major and minor subunit proteins, as well as a dedicated assembly apparatus consisting of a periplasmic chaperone and an outer membrane usher. In Chapter 4, we investigated the function of S fimbriae, a type of CU fimbriae frequently associated with extra-intestinal E. coli strains that cause severe acute pyelonephritis and neonatal meningitis. Analysis of the curated 1378 completely sequenced E. coli genome dataset revealed that the genes encoding S fimbriae were present primarily in phylogroup B2 strains, with 95% of the S fimbriae-positive strains belonged to this group. To explore S fimbrial function, we focused on the fimbrial subunit proteins. S fimbriae have previously been shown to bind to sialic acid, with early studies showing this binding was largely mediated by the SfaA major subunit and SfaS minor subunit proteins. However, this is inconsistent with our current knowledge of CU fimbrial architecture and function, and thus we sought to determine if this binding property was mediated by the tip-located SfaH adhesin. The genes encoding SfaA, SfaS, SfaH and the SfaG subunit protein were cloned, and each protein was expressed and purified under non-denaturing conditions. Interestingly, and consistent with previous studies, the SfaA major subunit protein demonstrated the highest binding affinity to the sialic acid glycan N-Acetyl-D-glucosamine, with SfaS demonstrating low binding affinity and no binding observed by SfaG or SfaH. To elucidate the binding specificity of the SfaH adhesin, the lectin binding domain was purified, and its binding capacity was assessed using a glycan array. In total, 40 different glycans were bound by SfaH, including blood group antigens, Lewis antigen structures, structures with lactose, and GM2. Attempts were also made to elucidate the crystal structure of the SfaH lectin binding domain. However, only long thin needle-like crystals were observed with initial crystallization screenings, preventing high- resolution of its atomic structure. One type of CU fimbriae, Yad fimbriae, have been shown to mediate adherence to intestinal epithelial cells and contribute to colonisation of the mouse bladder, however detailed mechanistic insight into their function remains to be elucidated. Work in Chapter 5 we aimed to enhance knowledge of Yad fimbriae and determine the binding characteristics of the YadC tip adhesin. Firstly, the prevalence of Yad fimbriae was assessed in a dataset comprising 1378 completely sequenced E. coli genomes. Overall, the prevalence of yad fimbriae genes displayed a variable distribution based on E. coli phylogeny, with 86% of strains from the B2 phylogroup shown to possess yad fimbriae genes compared to strains from phylogroups A (62%), B1 (65%), C (43%), D (1%), E (0%) and F (19%). To further characterise the function of Yad fimbriae, four gene clusters representing allelic variation of the YadC adhesin were cloned and expressed in a recombinant E. coli strain. Despite repeated attempts, expression of the Yad fimbrial variants was inconsistent, with only the yad fimbrial cluster from the ST131 strain EC958 demonstrating detectable surface-expressed fimbriae production. Further work therefore focused on attempts to express, purify and characterise the YadC tip adhesin. Like other characterised fimbrial adhesins such as FimH and PapG, the YadC adhesin comprises two distinct domains, an N-terminal lectin-binding domain and a C-terminal pilin domain. As the lectin-binding domain was predicted to mediate interaction with specific glycan receptors and thus tissue tropism, the sequence corresponding to this region was amplified by PCR and cloned into a series of expression vectors. Using this strategy, the lectin domain of two variant YadC alleles was purified under non-denaturing conditions. Unfortunately, despite multiple attempts, we were unable to produce diffracting crystals that could enable high-resolution analysis of the YadC structure. Taken together, this work enhances our understanding of the prevalence of E. coli adhesins and uncovered the functions of the YfaL and S fimbriae. A new strategy was proposed to explore the function of the Yad fimbriae and additional work is required to investigate the contribution of Yad fimbriae to bacterial pathogenesis.
Benzer Tezler
- Ankara koşullarında yetiştirilen yabancı kökenli bazı üzüm çeşitlerinin ampelografik özelliklerinin belirlenmesi üzerinde araştırmalar
Description of the ampelographic characters of some introduced grape varieties grown in Ankara conditions
İBRAHİM DEMİR
- Effect of membrane fluidity on binding of 125I-Insulin to sheep liver membrane receptors
Başlık çevirisi yok
HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
- Polietilenglikol esaslı bazı yeni oligoazoperoksiester başlatıcıların sentezi ve karekterizasyonu
Synthesis and characterization of some new oligoazoperoxyester initiators based on polyethyleneglycolos
ALİPAŞA AYAS
Yüksek Lisans
Türkçe
1988
Kimya MühendisliğiKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BAKİ HAZER
