Geri Dön

Rational design of L-alanine dehydrogenase variants for enhanced catalytic efficiency

Geliştirilmiş katalitik verimlilik için L-alanin dehidrogenaz varyantlarinin rasyonel tasarimi

PDF İndir

  1. Tez No: 956519
  2. Yazar: TUBA OKUR
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ONUR SERÇİNOĞLU, DOÇ. DR. FATİH AKTAŞ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 113

Özet

Amino asitler, hücresel yapının oluşumdan bağışıklık savunma ve onarım mekanizmalarına kadar çeşitli vücut fonksiyonlarının ayrılmaz bir parçası olan temel moleküllerdir. Amino asitler, çok yönlü biyolojik rolleri ve benzersiz kimyasal özellikleri nedeniyle çeşitli endüstrilerde de yaygın olarak kullanılmaktadır. L-alanin, ilaç endüstrisi, gıda üretimi ve veterinerlik gibi birçok alanda uygulamaları bulunan en küçük kiral amino asitlerden biridir. L-alanin dehidrogenaz (L-AlaDH) enzimi, kofaktör olarak NAD(H) ve NAD+ kullanarak pirüvatın L-alanine geri tersinir dönüşümünü katalize eder. Özellikle, indirgeyici aminasyon aktivitesi, NAD(H) varlığında pirüvatı L-alanine dönüştürür. L-AlaDH'nin oksidatif aktivitesi üzerine çok sayıda çalışma bildirilmiş olsa da, indirgeyici aminasyon aktivitesi yeterince araştırılmamıştır. Bu araştırma, ilk kez, Amycolatopsis sulphurea (L-AsAlaDH) kaynaklı L-AlaDH enziminin indirgeyici aminasyon aktivitesinin kapsamlı bir karakterizasyonunu bildirmektedir. Ayrıca, protein mühendisliği yoluyla üretilen gelişmiş katalitik aktiviteye sahip L-AsAlaDH varyantları belirlenmiş, ve bu varyantların indirgeyici aminasyon ve oksidatif deaminasyon aktiviteleri karakterize edilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında, rasyonel enzim mühendisliği yöntemleriyle mutantların tasarlanması, dönüşümü, ekspresyonu, saflaştırılması, ve biyokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, oksidatif deaminasyon ve indirgeyici aminasyon sırasında mutantların ve yabanıl tip L-AsAlaDH'ın enzim kinetiği parametrelerinin belirlendi. İndirgeyici aminasyonun metal bağlama kapasitesi ve depolama kararlılığı araştırıldı. Ayrıca, mutantların protein yapısına ve dinamiğine olan etkileri aktif bölge analizi ve klasik moleküler dinamik (MD) simülasyonları gerçekleştirilerek araştırıldı. Çalışmalar, yabanıl tip, Tyr14Asn, Ile97Leu ve Ser192Ala mutantlarının indirgeyici aminasyon aktivitesi için optimum çalışma koşullarının sırasıyla pH 9,0 ve 25°C, pH 9,0 ve 35°C, pH 9,5 ve 45°C, pH 10,0 ve 40°C olduğunu ortaya koydu. Oksidatif deaminasyon için ise sırasıyla pH 10,5 ve 25°C, pH 10,0 ve 30°C, pH 10,5,0 ve 40°C, pH 10,0 ve 35°C optimum koşullar olarak belirlendi. Tüm mutantlar, indirgeyici aminasyon için katalitik verimliliği 1,73 ila 3,13 kat ve oksidatif deaminasyon için 1,80 ila 3,04 kat arasında artırdı. Katalitik aktivitenin değişmesinin altında yatan mekanizmayı ortaya çıkarmak için, MD simülasyonları ve enzimlerin aktif bölgesi incelendi. Mutantların, aktif bölge aminoasitleri ve pirüvat arasındaki bağların veya bağ tiplerinin uzunluklarını değiştirdiği gözlendi. Ayrıca, mutantların global enzim dinamiği üzerinde de etkili oldukları gözlendi. Metallerin indirgeyici aminasyon enzim aktivitesi üzerinde önemli bir inhibe edici/artırıcı etkiye yol açtığı belirlendi. İndirgeyici aminasyon aktivitesinin depolama kararlılığının da, metal iyonların varlığından etkilendiği tespit edildi.

Özet (Çeviri)

Amino acids are extensively utilized across diverse industries, a testament to their multifaceted biological roles and unique chemical properties. Among these, L-alanine stands out as one of the smallest chiral amino acids, with broad applications in the pharmaceutical industry, food production, and veterinary medicine. The enzyme L-alanine Dehydrogenase (L-AlaDH) catalyzes the reversible conversion of pyruvate to L-alanine, utilizing NAD(H) and NAD+ as cofactors. Specifically, its reductive amination activity converts pyruvate to L-alanine in the presence of NAD(H). While numerous studies on the oxidative activity of L-AlaDH have been reported, its reductive amination activity remains insufficiently explored. This research presents, for the first time, a comprehensive characterization of the reductive amination activity of L-AlaDH derived from Amycolatopsis sulphurea (L-AsAlaDH). Furthermore, we identify and characterize L-AsAlaDH variants with enhanced catalytic activity generated through protein engineering, evaluating both their reductive amination and oxidative deamination activities. Within the scope of this thesis, we investigated the design of mutants using rational enzyme engineering methods, followed by their transformation, expression, purification, biochemical characterization, and determination of kinetic parameters. These investigations were performed for both wild-type L-AsAlaDH and its mutants during oxidative deamination and reductive amination. Additionally, the metal binding capacity and storage stability relevant to reductive amination were explored. Furthermore, the effects of the mutations were elucidated through active site modeling and Molecular Dynamics (MD) simulation analysis. Our studies revealed the optimum working conditions for the reductive amination activity of the wild-type and various L-AsAlaDH mutants: wild-type, pH 9.0 and 25°C; Tyr14Asn, pH 9.0 and 35°C; Ile97Leu, pH 9.5 and 45°C; and Ser192Ala, pH 10.0 and 40°C. For oxidative deamination, the optimal conditions were pH 10.5 and 25°C for the wild-type; pH 10.0 and 30°C for Tyr14Asn; pH 10.5 and 40°C for Ile97Leu; and pH 10.0 and 35°C for Ser192Ala. All mutants demonstrated an increased catalytic efficiency, ranging from 1.73- to 3.13-fold for reductive amination and 1.80- to 3.04-fold for oxidative deamination. To elucidate the reasons for these changes in catalytic activity, we investigated the active sites of the enzymes and conducted MD simulations. The mutations altered the lengths or types of bonds between the active site amino acids and pyruvate, and also influenced the overall enzyme dynamics, consequently affecting catalytic efficiency. Furthermore, analysis of the metal ion binding capacity and storage stability of the reductive amination activity showed that metal ions significantly inhibited or enhanced the enzyme's reductive amination activity. Storage stability was also influenced by the buffer composition, particularly the presence of metal ions within the protein solution. As a conclusion, this thesis demonstrates the impacts of site-directed mutations on L-AsAlaDH enzyme activity. Comprehending the enzyme's structure-activity relationship is of significant importance for future studies. Specifically, engineered L-AsAlaDH emerges as a promising candidate for industrial applications in pharmaceutical, food, and other key sectors.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    770750

    Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-DOPA production

    L-DOPA üretimi için Corynebacterium glutamicum metabolik mühendislik

    ELDIN KURPEJOVIC

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyomühendislikMarmara Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BERNA SARIYAR AKBULUT

  2. Tez No

    409932

    Bir boyutlu sıkıştırılmış silindirik nano geometrilerin, polipeptitlerin yapı ve dinamikleri üzerindeki etkileri

    Effects of one dimentional confined cylindrical nanogeometries on structure and dynamics of polypeptides

    EYLÜL TUNCEL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    KimyaTOBB Ekonomi ve Teknoloji Üniversitesi

    Mikro ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HATİCE DURAN

  3. Tez No

    104175

    Sanayii yapılarında üretim rolü ve idare bölümü arasındaki biçimleniş özellikleri

    Formal properties between the production hall and the adminstration section in the industrial buildings

    ÖMER ÇAMOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2001

    Mimarlıkİstanbul Teknik Üniversitesi

    Mimarlık Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. METE S. ÜNÜGÜR

  4. Tez No

    323830

    Stokastik talep altında telekomünikasyon ağlarındaki aracı firmalara yönelik kar en büyüklemesi problemi

    Profit maximization problem for intermediaries in telecommunication networks under stochastic demand

    HASAN HÜSEYİN TURAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Endüstri ve Endüstri Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Endüstri Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET NAHİT SERARSLAN

  5. Tez No

    904193

    Ulaştırma mühendisliğinde bulanık modelleme ile menfez tasarımı

    Fuzzy modeling approach to culvert design in transportation engineering

    ÖZAY USLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Ulaşımİstanbul Medipol Üniversitesi

    İnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEKAİ ŞEN

Geri Dön