RNAi aracılı gen susturma yönteminin bitki-patojen etkileşiminde kullanımı: PTTG_02001 efektör adayının fonksiyonel analizi
Use of RNAi-mediated gene silencing in plant-pathogene interaction: Functional analysis of PTTG_02001 effector candidate
- Tez No: 957617
- Danışmanlar: PROF. DR. SEMRA HASANÇEBİ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Biyoteknoloji, Ziraat, Genetics, Biotechnology, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Trakya Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
RNAi teknolojisi, tetikleyici molekülü dsRNA ile devreye giren kontrollü bir şekilde gen ifadesinin susturulmasını sağlayan organizmaların doğal gen regülasyonu ve savunma mekanizmasıdır. Uygulamada gen susturma tekniği olarak kullanılan bu teknoloji aday genlerin fonksiyonel analizinde de kullanılmaktadır. Buğday bitkisi dünyada ve ülkemizde önemli bir tahıl ürünü olarak tüketilmektedir. Buğday bitkisinin veriminin düşmesine sebep olan buğday kahverengi/yaprak pası bir mantar hastalığıdır. Hastalık etmeni patojen, Puccinia triticina Eriks (Pt), buğday bitkisinde yaygın görülen ve kaybın en fazla olduğu hastalıklarından biridir. Efektör proteinler, mantar patojenleri tarafından konakçının bağışıklık sistemini baskılar ve virülanslığı arttırıcı etki gösterir. Hastalığın kontrolünde etkin stratejiler geliştirmek için efektörleri tespit etmek ve RNAi teknolojisi gibi yöntemlerle virülanslıktaki etkinliğini ortaya koymak önemlidir. Çalışmada daha önce proteomik bir çalışma ile tespit edilmiş olan PTTG_02001 efektör adayının fonksiyonel analizi gerçekleştirilmiş ve aday genin gerçek efektör olduğu yönünde güçlü kanıtlar elde edilmiştir. Bu amaçla HIGS metodu kullanılarak RNAi ile PTTG_02001 geni susturulmuş ve enfeksiyon gelişimindeki etkinliği belirlenmiştir. PTTG_02001 efektör adayına spesifik 465 bp uzunluğunda bir RNAi02001 fragmenti tasarlanmış ve BSMV vektörüne klonlanmıştır. Hassas buğday çeşidi Morocco fideleri, RNAi02001 fragmentini taşıyan BSMV ile inoküle edilmiştir. Böylece virüs aracılığı ile efektör adayına özgü dsRNA molekülleri bitki hücrelerine aktarılarak çoğaltılmaları ve yeni hücrelere dağıtımı sağlanmıştır. BSMV inokülasyonun 10. gününde bitkiler Pt ırk1 urediniosporları ile inoküle edilmiş ve bitki-patojen etkileşimi sırasında dsRNA'ların patojene aktarılmaları sağlanmıştır. qRT-PCR analizleri yapılarak RNAi mekanizmasının etkinliği ve aday genin susturulma düzeyi belirlenmiştir. Ayrıca bitkilerdeki enfeksiyon gelişimi mikroskobik olarak ve enfeksiyon şiddeti ise Cobb skalasına göre değerlendirilmiştir. HIGS aracılı RNAi uygulaması sonucunda, PTTG_02001'in hedeflendiği test örneklerinde gen ekspresyonunun ortalama olarak 3. yapraklarda %76, 4. yapraklarda ise %95 oranında azaldığı görülmüştür. Buna paralel olarak test örneklerinde enfeksiyon şiddeti %10'un altında neredeyse 0 düzeyinde gözlenmiştir. Mikroskobik inceleme sonuçları bu bulguları destekler niteliktedir, test örneklerinde enfeksiyon yapılarının gelişim açısından oldukça gerilediği gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre aday gen PTTG_02001'in gerçek efektör olduğu tespit edilmiştir.
Özet (Çeviri)
RNA interference (RNAi) is a natural gene regulation and defense mechanism in organisms that enables the controlled silencing of gene expression through a double-stranded RNA (dsRNA) trigger molecule. This technology, commonly used as a gene silencing tool, is also employed in the functional analysis of candidate genes. Wheat is a major cereal crop consumed both globally and in Turkey. Wheat leaf rust, caused by the fungal pathogen Puccinia triticina Eriks (Pt), is one of the most prevalent and yield-limiting diseases affecting wheat production. Effector proteins secreted by fungal pathogens suppress host immune responses and enhance pathogen virulence. Identifying these effectors and elucidating their roles through techniques such as RNAi is critical for developing effective disease management strategies. In this study, the functional characterization of the effector candidate gene PTTG_02001, previously identified through proteomic analysis, was conducted, yielding strong evidence that the gene is a bona fide effector. The gene was silenced using the Host-Induced Gene Silencing (HIGS) approach, and its role during infection development was investigated. A 465 bp RNAi fragment specific to PTTG_02001 (termed RNAi02001) was designed and cloned into a Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) vector. Seedlings of the susceptible wheat cultivar 'Morocco' were inoculated with the recombinant BSMV carrying the RNAi02001 fragment. Through virus-mediated delivery, dsRNA molecules specific to the effector candidate were introduced into plant cells, where they were amplified and systemically distributed to new cells. On the 10th day post BSMV inoculation, plants were challenged with urediniospores of Pt race 1, facilitating the delivery of dsRNAs to the pathogen during the plant-pathogen interaction. The efficiency of the RNAi mechanism and the silencing level of the candidate gene were assessed via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Additionally, infection development was monitored microscopically, and disease severity was evaluated using the Cobb scale. As a result of RNAi-based HIGS application, PTTG_02001 transcript levels were reduced by approximately 76% in the third leaves and 95% in the fourth leaves of treated plants. Correspondingly, disease severity in test plants was observed to be below 10%, nearly approaching zero. Microscopic observations supported these findings, showing significantly reduced development of infection structures in the test samples. These results strongly support the conclusion that PTTG_02001 is a functional effector gene involved in the virulence of Puccinia triticina.
Benzer Tezler
- Milas (Muğla) ovasının hidrojeoloji incelemesi
Hydrogeological investigation of Milas (Muğla) plain
SUZAN AHMET ABDÜLHAMİT
- Ahmed-i Da'i Tıbb-ı Nebevi: İmla - fonetik - morfoloji - karşılaştırmalı metin, indeks ve sözlük, I. cilt
Başlık çevirisi yok
ÖNDER ÇAĞIRAN
Doktora
Türkçe
1992
Türk Dili ve Edebiyatıİnönü ÜniversitesiTürk Dili ve Edebiyatı Eğitimi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. GÜRER GÜLSEVİN
