Tarihi el yazmasından izole edilen selülaz üreten bir bakterinin selülolitik potansiyelinin araştırılması
Investigation of the cellulolytic potential of cellulase producing bacteria isolated from historical manuscripts
- Tez No: 958555
- Danışmanlar: PROF. DR. ESRA SUNGUR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Yazma eserler, bir toplumun kültürel mirasını ve bilgi birikimini yansıtan, geçmişten geleceğe köprü vazifesi gören önemli belgelerdir. Ancak, kağıdın yüksek selüloz içeriği ve üretiminde kullanılan çeşitli dolgu maddeleri, biyolojik olarak degredasyona uğrayabilmektedir. Bu durum, tarihsel izlerin zamanla kaybolmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, yazma eserlerin konservasyonu, toplumlar açısından büyük önem taşımakta ve üzerinde titizlikle durulması gereken bir konu olarak öne çıkmaktadır. Kültürel miras niteliğindeki kağıt tabanlı yazma eserlerin maruz kaldığı en önemli tehditlerden biri, selülolitik aktiviteye sahip mikroorganizmaların neden olduğu biyolojik bozunmadır. Bu alanda yapılan çok sayıda çalışma, kağıt materyaller üzerindeki mikrobiyal kontaminantların büyük ölçüde Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria ve Bacteroidota filumlarına dahil olduğunu göstermektedir. Yazma eserlerden izole edilen mikroorganizmalar arasında; Bacillus türleri, Massilia timonae, Arthrobacter agilis, Oceanobacillus polygoni, Microbacterium foliorum, Staphylococcus warneri ve Pseudomonas chengduensis vb. bakteriler bulunmaktadır. Ayrıca, önceki çalışmamız kapsamında tarihi yazma eserlerden Kocuria rosea ve Chryseobacterium hispalense türleri de izole edilmiş olup, bu bakterilerin selülozu parçalama yeteneğine sahip olduğu tespit edilmiştir. Yazma eserlerin bakteriyolojik degredasyonuna dair bilgi sahibi olabilmek için, selülolitik bakteri türlerinin tanımlanmasının yanı sıra degredasyon çalışmalarının da gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Yüksek selülaz enzimi üretme yeteneğine sahip bakterilerin selülaz enzimlerinin etkinliğinin incelenmesi, yazma eserlerin biyodegredasyon mekanizmalarının anlaşılması açısından büyük önem arz etmektedir. Ancak, yazma eserler üzerine gerçekleştirilen çalışmalarda K. rosea ve C. hispalense bakteri türlerinin kağıt üzerine degredasyon etkisinin uzun süreli, detaylı ve çok yönlü olarak incelendiği bir çalışma bulunmamaktadır. Bu tez çalışmasında, yazma eserden izole edilen yüksek selülolitik aktivite gösteren K. rosea'nın, Whatman No. 1 filtre kağıdı üzerine degredatif etkisi olup olmadığının ortaya konulması hedeflenmiştir. Beraberinde K. rosea'nın selülaz enzimi aktivitesinin optimizasyon çalışmaları ilk kez gerçekleştirilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında, ilk başta 2 farklı bakteri türü (K. rosea ve C. hispalense) ile çalışmalara başlanmıştır. Öncelikle, her iki bakteri türünün de fenotipik ve biyokimyasal özellikleri ortaya konmuş ve büyüme eğrileri elde edilmiştir. Daha sonra, C. hispalense'nin selülaz enzimi üretimini teşvik eden en uygun besiyerinin belirlenmesi amacıyla, 4 farklı besiyerinde (A, B, C ve D) bakterinin büyüme eğrisi ve DNS yöntemi ile selülaz enzimi üretim profili incelenmiştir. Yapılan analizler sonucunda, açısından en yoğun büyüme B besiyeri'nde olmakla birlikte, selülaz enzimi üretimi bakımından en uygun ortamın D besiyeri olduğu belirlenmiştir. D besiyerinde hem bakteri büyümesini hem de selülaz enzim aktivitesini daha da artırmak amacıyla optimizasyon çalışmaları yürütülmüştür. Deneyler sırasında, C. hispalense'nin sıvı D besiyerinde büyüme yeteneğinin azaldığı gözlemlenmiş ve bu nedenle çalışmalara K. rosea ile devam edilmiştir. K. rosea'nın bakteri süspansiyonu LB sıvı besiyerinde hazırlandığında, FTS'ye kıyasla daha yüksek selülaz aktivitesi (1.18 OD) gösterdiği tespit edilmiş olup, sonraki deneylerde bakteri süspansiyonu LB besiyerinde hazırlanarak çalışmalar sürdürülmüştür. K. rosea'nın selülaz enzim aktivitesinin optimum gerçekleştiği sıcaklık ve pH değerlerinin tespiti için, bakteri“sıvı D besiyeri”ne ekilmiştir. On gün inkübasyonu boyunca büyüme dinamiği ve selülaz enzimi üretme davranışı incelenmiştir. 30°C üzerindeki inkübasyon sıcaklıklarında bakterinin selülaz enzim aktivitesini sergilemesinde gün bazında gecikme gözlenmekle beraber, 37°C ve 45°C'de özellikle 5. günden itibaren enzim aktivite düzeylerinin anlamlı şekilde daha yüksek olduğu belirlenmiştir. K. rosea'nın D besiyerinde en yüksek selülaz enzim aktivitesini ve büyümeyi 37°C'de gösterdiği belirlenmiştir. K. rosea'nın, özellikle asidik ortamlarda selülaz enzim aktivitesi ve büyüme gösterme yeteneğinin sınırlı olduğu belirlenmiştir. En yüksek selülaz enzim aktivitesi ve büyüme yoğunluğunun pH 8 koşulunda gerçekleştiği ortaya konmuştur. K. rosea'nın selülaz enzimi üretimi için optimum koşulları belirlendikten sonra, kağıt üzerine degredatif etkisini incelemek amacıyla, degredasyon çalışmalarında sandviç yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntemde, alt katman olarak minimal agar (MA) kullanılırken, karbon kaynağı olarak Whatman No. 1 filtre kağıdı MA besiyerinin üzerine yerleştirilmiştir. Model kağıt olarak Whatman No. 1 filtre kağıdı No.1 tercih edilmiştir. Yöntem iki farklı üst katman besiyeri (yarı-katı MA, yarı-katı LB) kullanılarak iki farklı şekilde (MA yöntemi ve LBA yöntemi) gerçekleştirilmiştir. Tüm besiyerlerinin pH değeri 8'e ayarlanmıştır. Bu tez çalışmasında ilk kez, gerekli nem koşulları sağlanarak filtre kağıtları sandviç yöntemiyle 50 gün boyunca inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyonlar 37°C'de gerçekleştirilmiştir. Belirli örnekleme günlerinde (5., 20., 35. ve 50.) petri kutularından alınan filtre kağıdı örneklerine çeşitli analizler (bakteriyolojik, kolorimetrik ve FTIR analizleri) uygulanmıştır. Bakteriyolojik analizler sonucunda, bakterilerin filtre kağıdına tutunduğu tespit edilmiş olup, inkübasyonun 5. gününde LBA ve MA yöntemi uygulanan filtre kağıtlarındaki canlı bakteri sayıları ise sırasıyla, 756x105 kob/cm2 ve 27.3x105 kob/cm2 olarak belirlenmiştir. İnkübasyonun 35. ve 50. günlerinde filtre kağıtları canlı/ölü boyama tekniği ile boyanmış ve bakteriler epifloresan mikroskopta incelenmiştir. Filtre kağıdının lifli yapısından kaynaklı olarak bakterilerin tamamı yüzeyde gözlemlenememiş ve bu nedenle sayım yapılamamıştır. Ancak, bu yöntem sayesinde bakterilerin 50. güne kadar canlı kaldığı doğrulanmıştır. LBA ve MA yöntemleri uygulanarak K. rosea'ya maruz bırakılan Whatman No. 1 filtre kağıtlarının (BW örneklerinin) degredasyonu, inkübasyon süresince toplam renk değişimi (ΔE) açısından incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, deney yönteminin degredasyon düzeyi üzerine belirleyici olduğunu göstermiştir. LBA yöntemi uygulanan örneklerdeki toplam renk değişiminin (ΔE), MA yöntemine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek olduğu bulunmuştur (p<0.05). Bu fark, inkübasyonun 50. gününde en belirgin seviyeye ulaşmıştır. Ayrıca, LBA yöntemi uygulanan 50. gün BW örneğinin Δb* değeri, belirgin şekilde MA yöntemine kıyasla daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu durum, BW örneğinde daha ileri düzeyde bir sararma ve dolayısıyla daha fazla degredasyon meydana geldiğine işaret etmektedir. Ayrıca, LBA ve MA yöntemleri uygulanarak K. rosea'ya maruz bırakılan Whatman No. 1 filtre kağıtlarının (BW örneklerinin) degredasyonu, inkübasyon süresince FTIR-ATR analizi ile yapısındaki kimyasal bileşenlerin ve fonksiyonel grupların değişimleri açısından incelenmiştir. Örneklerin FTIR spektrumunda selüloza özgü karakteristik dalga boylarının (1250 cm-1- 800 cm-1 aralığı) yanı sıra filtre kağıdının yapısında tutkala atfedilen dalga boyları (2900 cm-1 ve 1292 cm-1) tespit edilmiştir. K. rosea'ya maruz bırakılan örneklerde ise bu temel dalga boylarına ek olarak, amid I ve amid II bandlarına karşılık gelen 1652 cm⁻¹ ve 1548 cm⁻¹ dalga boylarında bakteriyal biyokütleye özgü piklerin varlığı belirlenmiştir. Degredasyonun en önemli göstergesi ise, 1740 cm⁻¹ dalga boyundaki (karbonil/karboksil bölgesi) absorbans artışıdır. 35. günden itibaren daha da belirginleşen bu artış, 50. günde en yüksek seviyesine ulaşmıştır. İnkübasyonun 50. gününde, LBA yöntemi uygulanan örnekteki absorbans artışının, MA yöntemindeki artışa kıyasla daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu bulgu, LBA yöntemi uygulanan örneklerde bakteriyal aktivitenin daha fazla oksidatif ürün birikimine ve dolayısıyla selülozun kristal yapısında degredasyona yol açtığına işaret etmektedir. Bununla birlikte selülozun amorf bölgesine ait dalga boyu olan 897 cm-1 bandında ise, LBA yöntemi uygulanan BW örneklerinde 35. güne kadar amorf bölgenin arttığı, sonrasında da daha ileri degredasyon ve yeniden kristalleşme süreçlerinin başladığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yazma eserden izole edilen selülaz aktivitesine sahip K. rosea, en yüksek selülaz enzimi aktivitesini (0.27 U/mL) 37°C'de ve pH 8 koşullarında sergilemekte olup, Whatman No. 1 filtre kağıdında degredasyona yol açmaktadır. Ayrıca, elde edilen veriler doğrultusunda, yöntemler arasındaki farklılıklar, kağıt degredasyonu deneylerinde uzun inkübasyon süresinin, uygulanan yöntemin ve kullanılan besiyerinin en verimli sonuca ulaşmak açısından en kritik faktörler olduğunu ortaya koymuştur.
Özet (Çeviri)
Manuscripts are crucial documents that reflect a society's cultural heritage and accumulated knowledge, serving as a bridge from the past to the future. However, the high cellulose content of paper and the various fillers used in its production can lead to biological degradation. This degradation can cause historical traces to vanish over time. Therefore, the conservation of manuscripts is of great importance for societies and stands out as a subject requiring meticulous attention. One of the most significant threats to paper-based manuscripts, which are cultural heritage assets, is biological degradation caused by microorganisms with cellulolytic activity. Numerous studies in this field indicate that microbial contaminants on paper materials largely belong to the phyla Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, and Bacteroidota. Among the microorganisms isolated from manuscripts are bacteria such as Bacillus species, Massilia timonae, Arthrobacter agilis, Oceanobacillus polygoni, Microbacterium foliorum, Staphylococcus warneri, and Pseudomonas chengduensis. Furthermore, in our previous work, Kocuria rosea and Chryseobacterium hispalense were isolated from historical manuscripts, and these bacteria were found to possess the ability to degrade cellulose. To gain knowledge about the bacteriological degradation of manuscripts, in addition to identifying cellulolytic bacterial species, degradation studies must also be conducted. Examining the efficacy of cellulase enzymes produced by bacteria with high cellulase enzyme production capabilities is of great importance for understanding the biodegradation mechanisms of manuscripts. However, no long-term, detailed, and multifaceted studies investigating the degradation effect of K. rosea and C. hispalense bacterial species on paper have been carried out on manuscripts. This thesis aimed to determine whether K. rosea, isolated from a manuscript and exhibiting high cellulolytic activity, has a degradative effect on Whatman No. 1 filter paper. Additionally, optimization studies for K. rosea's cellulase enzyme activity were performed for the first time. Within the scope of this thesis, initial studies commenced with two different bacterial species (K. rosea and C. hispalense). First, the phenotypic and biochemical characteristics of both bacterial species were determined, and their growth curves were obtained. Subsequently, to identify the most suitable medium for promoting cellulase enzyme production by C. hispalense, the bacterium's growth curve and cellulase enzyme production profile were examined using the DNS method in four different media (A, B, C, and D). As a result of the analyses, it was determined that while the densest growth occurred in medium B, medium D was the most suitable for cellulase enzyme production. Optimization studies were conducted in medium D to further enhance both bacterial growth and cellulase enzyme activity. During the experiments, a decrease in C. hispalense's growth ability in liquid D medium was observed, and therefore, studies continued with K. rosea. When K. rosea's bacterial suspension was prepared in LB liquid medium, it showed higher cellulase activity (1.18 OD) compared to FTS, and thus, subsequent experiments were carried out with the bacterial suspension prepared in LB medium. To determine the optimal temperature and pH values for K. rosea's cellulase enzyme activity, the bacterium was inoculated into“liquid D medium.”Its growth dynamics and cellulase enzyme production behavior were examined over ten days of incubation. Although a day-based delay in the bacterium's cellulase enzyme activity was observed at incubation temperatures above 30°C, enzyme activity levels were significantly higher at 37°C and 45°C, especially from the 5th day onwards. It was determined that K. rosea exhibited the highest cellulase enzyme activity and growth in D medium at 37°C. K. rosea's ability to show cellulase enzyme activity and growth, particularly in acidic environments, was found to be limited. The highest cellulase enzyme activity and growth density occurred at pH 8. After determining the optimum conditions for K. rosea's cellulase enzyme production, the sandwich method was used in degradation studies to examine its degradative effect on paper. In this method, minimal agar (MA) was used as the bottom layer, while Whatman No. 1 filter paper, as the carbon source, was placed on top of the MA medium. Whatman No. 1 filter paper was chosen as the model paper. The method was performed in two different ways (MA method and LBA method) using two different top layer media (semi-solid MA, semi-solid LB). The pH of all media was adjusted to 8. In this thesis, for the first time, filter papers were incubated for 50 days using the sandwich method, ensuring the necessary humidity conditions. Incubations were carried out at 37°C. At specific sampling days (5th, 20th, 35th, and 50th), filter paper samples taken from petri dishes were subjected to various analyses (bacteriological, colorimetric, and FTIR analyses). Bacteriological analyses revealed that bacteria adhered to the filter paper, with live bacterial counts on filter papers subjected to the LBA and MA methods on the 5th day of incubation being 756×105 cfu/cm2 and 27.3×105 cfu/cm2, respectively. On the 35th and 50th days of incubation, filter papers were stained with a live/dead staining technique and bacteria were examined under an epifluorescence microscope. Due to the fibrous structure of the filter paper, not all bacteria could be observed on the surface, and thus, counting was not possible. However, this method confirmed that the bacteria remained viable until the 50th day. The degradation of Whatman No. 1 filter papers (BW samples) exposed to K. rosea using the LBA and MA methods was examined in terms of total color change (ΔE) during the incubation period. The results showed that the experimental method was a determining factor in the level of degradation. The total color change (ΔE) in samples treated with the LBA method was found to be statistically significantly higher than that in the MA method (p<0.05). This difference reached its most prominent level on the 50th day of incubation. Furthermore, the Δb∗ value of the 50-day BW sample treated with the LBA method was significantly higher compared to the MA method. This indicates a more advanced level of yellowing and thus more degradation in the BW sample. Additionally, the degradation of Whatman No. 1 filter papers (BW samples) exposed to K. rosea using the LBA and MA methods was examined in terms of changes in chemical components and functional groups in their structure via FTIR-ATR analysis during the incubation period. In the FTIR spectrum of the samples, in addition to characteristic cellulose-specific wavelengths (1250 cm−1−800 cm−1 range), wavelengths attributed to glue in the filter paper's structure (2900 cm−1 and 1292 cm−1) were detected. In samples exposed to K. rosea, in addition to these fundamental wavelengths, the presence of bacterial biomass-specific peaks at 1652 cm−1 and 1548 cm−1 corresponding to amide I and amide II bands was determined. The most significant indicator of degradation was the increase in absorbance at 1740 cm−1 (carbonyl/carboxyl region). This increase, which became more pronounced from the 35th day, reached its highest level on the 50th day. On the 50th day of incubation, the increase in absorbance in the sample treated with the LBA method was found to be higher compared to the increase in the MA method. This finding indicates that bacterial activity in samples treated with the LBA method led to greater accumulation of oxidative products and consequently degradation in the crystalline structure of cellulose. Furthermore, at the 897 cm−1 band, which is the wavelength of the amorphous region of cellulose, it was determined that the amorphous region increased up to the 35th day in BW samples treated with the LBA method, followed by the initiation of further degradation and recrystallization processes. In conclusion, K. rosea, a cellulase-active bacterium isolated from a manuscript, exhibits its highest cellulase enzyme activity (0.27 U/mL) at 37°C and pH 8 conditions, causing degradation in Whatman No. 1 filter paper. Furthermore, in light of the obtained data, the differences between the methods revealed that a long incubation period, the applied method, and the used medium are the most critical factors for achieving the most efficient results in paper degradation experiments.
Benzer Tezler
- Contribution a la recherche d'un cadre juridique pour un droit international de laconcurrence plus efficace
Daha etkin bir uluslararası rekabet için hukuki çerçeve arayışı
ALİ CENK KESKİN
Doktora
Fransızca
2009
HukukGalatasaray ÜniversitesiKamu Hukuku Ana Bilim Dalı
PROF. DR. JEAN MARC SOREL
PROF. DR. HALİL ERCÜMENT ERDEM
- Bristol Psalter resimli el yazmasındaki ikonografik kompozisyonlar (British Library - Add Ms 40731)
Iconographic compositions in Bristol Psalter illustrated manuscript (British Library - Add Ms 40731)
ALİ CAN ÖZÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Sanat TarihiSelçuk ÜniversitesiSanat Tarihi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSTAFA ÇETİNASLAN
- Konya Yazma Eserler Bölge Müdürlüğünde bulunan Süryanice el yazmalarının kataloglanması
A catalog of Syriac manuscripts held at the Konya Regional Directorate of Manuscripts
HATİCE ÖZBEK
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Eski Çağ Dilleri ve KültürleriMardin Artuklu ÜniversitesiSüryani Dili ve Kültürü Ana Bilim Dalı
DR. KUTLU AKALIN
- Matbaa ve Osmanlı toplumu arasındaki entelektüel ilişkiler
The intellectual relations between the printing press and the Ottoman society
SELİN KARA
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
FelsefeAnkara ÜniversitesiFelsefe Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELEK DOSAY GÖKDOĞAN