Development of real-time PCR kit for Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella spp.
Brucella abortus, Brucella melitensis ve Brucella spp. için gerçek zamanlı PCR kiti geliştirilmesi
- Tez No: 961203
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULHALİM KILIÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Bruselloz enfeksiyonu dünyada ve Türkiye'de hızla yayılan insan ve hayvan sağlığını etkileyen zoonotik bir enfeksiyondur. Pastörize edilmemiş süt ve süt ürünleri tüketimi veya enfekte hayvanlarla temas yoluyla bulaşan bruselloz; ateş, eklem ağrısı ve terleme gibi belirtiler gösterebilir. Enfeksiyonun ilerleyen aşamalarında ise kronik hastalıklara hatta ölüme kadar yol açtığı bilinmektedir. Özellikle B. melitensis ve B. abortus türleri hayvanlardan insanlara bulaşarak enfeksiyona neden olmaktadır ve bağışıklığı baskılanmış bireylerde, hayvancılıkla uğraşan toplumlarda yüksek morbiditeye sebep olmaktadır. Tanıda yaşanan gecikmelerle bulaş riski artarken ekonomik kayıplar da meydana gelmektedir. Geleneksel tanı yöntemleri serolojik testler ve kültür yöntemleridir. Serolojik testlerin çapraz reaksiyon verme riski, kültür yöntemlerinin ise alın standart olarak kabul edilmesine rağmen uzun süren sonuç alma süresi ile biyogüvenlik riski taşıması açısından kullanılabilirliği sınırlıdır. Bu nedenle güvenilir, hızlı ve hassas tanı yöntemlerine ihtiyaç doğmaktadır. Moleküler tanı yöntemleri hızlı, hassas ve özgül olması ile öne çıkmaktadır. Ayrıca erken tanı sağlayarak bulaş riskini azaltarak enfeksiyonun yayılımının önüne geçilmesinde büyük rol oynamaktadır. Moleküler tanı yöntemi olan, PCR yöntemi ile enfeksiyona neden olan patojenin genetik materyali çoğaltılarak kesin tanı konulmasına olanak sağlamaktadır. PCR tanı yöntemleri hızlı ve hassas olmasına rağmen diğer yöntemler gibi bazı dezavantajlara da sahiptir. Laboratuvar koşullarına profesyonel kullanıcılar tarafından kullanılması ve nükleik asit izolasyonu gibi ek işlemler gerektirmesi açısından bazı dezavantajları olsa da tıbbi tanıda, genetik araştırmalarda ve bir çok laboratuvar tabanlı araştırmalarda faydalı bir moleküler araçtır. Bu çalışmada moleküler tanı yöntemlerinden olan Brucella spp. tespitine yönelik real-time PCR tanı kiti geliştirilmesi ile beraber pozitif örneklerden tür ayrımı yapabilen B. abortus/B. melitensis qPCR kiti geliştirilmiştir. Bu kapsamda, iki kit için de hedeflenen türlere özgü primer ve prob tasarımları NCBI biyoinformatik araçları kullanılarak tasarlanmıştır. Brucella spp. tanısının daha hassas olması için iki ayrı gen bölgesinden iki farklı primer ve prob tasarımları gerçekleştirilerek yüksek hassalık ve özgüllükle Brucella tanısının sağlanması hedeflenmiştir. Brucella spp. qPCR ile pozitif tanı konulan örneklerden de B. melitensis/ B. abortus kiti ile tür tayini gerçekleştirilmektedir. Tasarlanan kitlerin güvenilebilirliğini ve doğruluğunu inceleyebilmek için tespit limiti, analitik hassaslık, analitik özgüllük, endojen girişim yapan maddeler, kesinlik ve klinik çalışmalardan oluşan validasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalardan ilki olan tespit limiti çalışmasında Brucella spp. qPCR kiti için Brucella referans örnekleri seri dilüsyonlarla hazırlanmış belirli konsantrasyonlarda negatif kan kültürü, tam kan ve sinoyval sıvı örneklerine eklenmiştir. Yapay kontaminasyon ile hazırlanan örnekler manyetik boncuk tabanlı nükleik asit izolasyonu ve Zybio EXM3000 nükleik asit izolasyon sistemi ile ekstrakt edilmiştir ve termal protokol ile MIC qPCR cihazında çalışılmıştır. B. abortus/B. melitensis qPCR kiti için de B. abortus ve B. melitensis referans örnekleri negatif kan kültürü, tam kan ve sinovyal sıvı örneklerine belirli dilüsyonlarda eklenmiştir ve hazırlanan numunelerden manyetik boncuk tabanlı nükleik asit izolasyonu ve Zybio EXM3000 nükleik asit izolasyon sistemi ile ekstrakt edilmiştir ve termal protokol ile MIC qPCR cihazında çalışılmıştır. Brucella spp. qPCR kitinde yapılan tespit limiti çalışmaları sonucunda tam kanda 250 kopya/mL, pozitif kan kültüründe 100 kopya/mL ve sinovyal sıvı örneklerinde 250 kopya/mL tespit limiti elde edildi. Tür ayrımı yapan kit için ise tespit limiti kan kültürü için 200 kopya/mL, tam kan için 750 kopya/mL ve sinoyval sıvı için 500 kopya/mL olarak elde edildi. Kitlerin analitik hassaslığını belirlemek için yapılan içleyicilik çalışmalarında farklı referans Brucella türleri negatif tam kan örneklerine eklenilerek Zybio EXM3000 nükleik asit izolasyon sistemi ile izolasyonu sonucunda hazırlanan numuneler kullanılmıştır. Brucella spp. qPCR kitinde 6 farklı Brucella türünün tespit edilebildiği belirlenmiştir. B. abortus/ B. melitensis qPCR kitinde ise hedef B. abortus ve B. melitensis referans numuneleri tam kan örneklerine eklenmiştir ve Zybio EXM3000 nükleik asit izolasyonu ile elde edilen ekstraktlardan hedef türlerin tespiti gerçekleştirilmiştir. Her iki kitin de tam kan örneklerinde hedeflenen türleri tespit edebildiği doğrulanmıştır. Analitik özgüllük, dışlayıcılık çalışmalarında ise genetik benzerlik gösteren ve çevre kontaminantı olabilecek patojenlerle çalışılmıştır. Bu patojenler tam kan örneklerine belirli konsantrasyonlarda eklenerek her iki kit ile de çalışılmıştır ve herhangi bir çapraz reaktivite gözlemlenmemiştir. NCBI araçları kullanılarak yapılan in-silico analizlerde de yalnızca hedeflenen türlerle eşleşmeler saptanmıştır. Hedeflenmeyen türlerle ise herhangi bir çapraz reaksiyon görülmemiştir. Bir sonraki çalışmada, Brucella örneklerinde karşılaşılabilecek veya qPCR prosedüründe kullanılabilen çeşitli potansiyel girişim yapan maddeler değerlendirilmiştir. Potansiyel girişim yapan maddeler yapay kontamine edilmiş örneklere belirli konsantrasyonlarda eklenerek kitlerin performansı değerlendirilmiştir. Kan, bilirubin, etanol ve çamaşır suyunun kitin performansını etkileyebildiği diğer maddelerin ise kitin performansını etkilemediği gözlemlenmiştir. Kitlerin doğruluğu ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için yapılan çalışmalarda ise kitler üç günde üç farklı konsantrasyonlarda ve üç tekrarlı olmak üzere uygun termal protokollerde ayrı ayrı çalışılmıştır. Çalışmalarda Brucella spp. qPCR kiti için Brucella spp. referans örnekleri, tür ayrımı yapan kit için ise B. abortus ve B. melitensis referans örnekleri tam kan örneklerine belirli konsantrasyonlarda eklenmiştir. Elde edilen sonuçlar kapsamında varyasyon katsayıları %5'in altında elde edilerek kitlerin güvenilebilirliğinin yüksek olduğu belirlenmiştir. Son validasyon çalışmalarından biri olan klinik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Medipol Mega Üniversite Hastanesi'nden 630 klinik örnek alınmıştır. Alınan 630 klinik örneğin 330'unun pozitif olduğu bilinmektedir ve tüm örnekler Brucella spp. qPCR kiti ile çalışılmıştır. 330 pozitif örneğin 317 tanesi doğru pozitif olarak elde edilmiştir ve 13 tanesi yanlış negatif olarak tespit edilmiştir. Kalan 300 örnek ise doğru negatif olrak tespit edilmiştir. Kitin hassaslığı %96,06 ve özgüllüğü %100 olarak elde edilmiştir. Kitin negatif tahmin değeri %95.85 ve pozitif tahmin değeri ise %100 olarak hesaplanmıştır. B. abortus/ B. melitensis qPCR kiti ile 330 pozitif numune çalışılmıştır. Bu numunelerin ise 123'ünün B. abortus türüne 162'sinin B. melitensis türüne ait olduğu bulunmuştur. Kalan 45 örneğin ise diğer Brucella türlerine ait olduğu belirlenmiştir. Geliştirilen her iki kit de kısa sürede sonuç verme ve yüksek doğruluk oranı ile insan sağlığında klinik açıdan rutin kullanılabilecek düzeyde potansiyele sahiptir. Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen kitler bruselloz tanısının ve tür ayrımını hızlı ve hassas bir şekilde yapabilmek açısından önemli bir adımdır. Bruselloz tanısı ile beraber sağlık sektöründe tedavilere yön verebilecek moleküler tabanlı bir araçtır ve halk sağlığını iyileştirme potansiyeli yüksektir.
Özet (Çeviri)
Brucellosis infection is a zoonotic disease that is rapidly spreading in the world and in Türkiye and affects human and animal health. Especially Brucella melitensis and Brucella abortus species are transmitted from animals to humans and cause high morbidity in societies dealing with animal husbandry. Current diagnostic methods are generally culture-based, cause false-positive results, are time-consuming and have limited widespread availability in terms of biosecurity. Therefore, there is a need for reliable, rapid and sensitive diagnostic methods.In this study, a real-time polymerase chain reaction (qPCR) diagnostic kit was developed for the detection of Brucella spp., which is one of the molecular diagnostic methods, and a B. abortus/ B. melitensis Real-Time PCR kit that can distinguish species from positive samples was developed. Specific primer and probe designs were carried out for both kits, and it was aimed to provide Brucella diagnosis with high sensitivity and specificity. Validation studies were carried out to examine the reliability and accuracy of the designed kits. The first of these studies is the detection limit study and reference samples for the Brucella spp. qPCR kit were spiked into negative blood culture, whole blood and synovial fluid samples. Nucleic acid isolations were performed from the prepared samples and studies were performed with the MIC qPCR cycler. As a result of the studies, a detection limit of 250 copies/mL was obtained in whole blood, 100 copies/mL in positive blood culture and 250 copies/mL in synovial fluid samples. For the species discrimination kit, the detection limit was obtained as 200 copies/mL for blood culture, 750 copies/mL for whole blood and 500 copies/mL for synovial fluid. Different Brucella species were used within the scope of the analytical sensitivity studies of the kits, and it was confirmed that both kits could detect the targeted species in whole blood samples. No cross-reactivity was observed in analytical specificity studies. In in-silico analyses using NCBI tools, only matches with the targeted species were detected. In studies conducted for the accuracy and reproducibility of the kits, the kits were studied in 3 different concentrations in 3 days, and the coefficients of variation were obtained below 5%, indicating that the reliability of the kits was high. Various potential interfering substances were also evaluated with interference studies, and it was observed that blood, bilirubin, ethanol and bleach could affect the performance of the kit. Finally, 330 of the 630 clinical samples taken from Medipol Mega University Hospital were studied with the Brucella spp. qPCR kit and 317 of the samples were true positive and 13 were false positive. The sensitivity of the kit was 96.06% and the specificity was 100%. With the B. abortus/ B. melitensis qPCR kit, it was found that 123 of the 330 positive samples belonged to B. abortus and 162 to B. melitensis. Both developed kits have the potential to be used routinely in human health in terms of clinical aspects with their high accuracy and quick results. As a result, it is an important step in terms of being able to diagnose brucellosis and differentiate its types quickly and is a tool that can guide treatments in the health sector along with diagnosis.
Benzer Tezler
- Kanatlı hayvanlarda yaygın olarak görülen viral ve bakteriyel patojenlerin multipleks PCR tabanlı hızlı tanısı için kit geliştirilmesi
Development of a multiplex PCR-based test kit for the rapid diagnosis of common viral and bacterial pathogens in poultry
CEM MÜJDE
Doktora
Türkçe
2025
BiyoteknolojiÇukurova ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BİLGE KAAN TEKELİOĞLU
- Gıda patojenlerinin tespiti için floresan temelli ekonomik DNA test yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of economical flourescence based DNA test methods for foodborne pathogen detection
AHMET KAYNAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
BiyomühendislikÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiBiyomühendislik ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ERGÜN ŞAKALAR
- HCV viral yükünün saptanmasında real time PZR temelinde bir yöntem geliştirilmesi
Development of a new method based on real time PCR for assessment of HCV viral load.
ABBAS ALİ HUSSEİNİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyoteknolojiAnkara ÜniversitesiTemel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MİTHAT BOZDAYİ
- Mitokondriyal DNA genomu tek nükleotid polimorfizminin real tıme PCR cihazı ile idantifikasyonu ve standardizasyonu
Identification and standardization of mitochondrial DNA single nucleotide polymorphism with real-time PCR instrument
KADİR DAŞTAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiFen Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ERSİ ABACI KALFOĞLU
- Adli DNA analizlerinde kullanılmak üzere multipleks STR kiti oluşturulması
Design of multiplex kit for using in forensic DNA analysis
İBRAHİM SEMİZOĞLU
Doktora
Türkçe
2016
Adli TıpHacettepe ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HATİCE MERGEN