Geri Dön

The investigation of disease associated NOD2 in human eosinophilic cells in the context of viral immunity by in vitro analysis

Hastalıkla ilişkili NOD2'nin viral bağışıklık bağlamında insan eozinofil hücrelerinde in vitro araştırılması

  1. Tez No: 961752
  2. Yazar: EDANUR BARUTÇU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. CEREN ÇIRACI MUĞAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 73

Özet

Eozinofiller, parazitik enfeksiyonlar ve alerjik reaksiyonlardaki bilinen rolleriyle tanınan çok işlevli bağışıklık hücreleridir. Bununla birlikte, antiviral bağışıklığa yaptıkları katkılar son zamanlarda artan bir ilgi görmektedir. Bu granülositler, eozinofil katyonik protein (ECP), eozinofil türevli nörotoksin (EDN) ve majör temel protein (MBP) gibi sitotoksik proteinler bakımından zengin sitoplazmik granüllerin yanı sıra doğuştan gelen ve sonradan kazanılan bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesinde rol oynayabilecek sitokinler ve kemokinler içerir. Ayrıca, belirli koşullar altında antijen sunan hücreler olarak hareket ederek T hücresi aracılı bağışıklık yanıtlarının aktivasyonuna ve modülasyonuna katkıda bulunabilirler. Bu gözlemler, viral enfeksiyonlar sırasında eozinofil işlevini kontrol eden potansiyel düzenleyici yolların araştırılmasına yol açmıştır. Eozinofillerin periferik kandaki düşük miktarda bulunması (tipik olarak dolaşımdaki lökositlerin %1-4'ü) ve ex vivo canlılıklarının sınırlı olması nedeniyle, primer eozinofiller üzerinde işlevsel ve mekanistik çalışmalar yürütmek kayda değer teknik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için bu çalışmada, matür eozinofillerin çeşitli morfolojik ve immünolojik özelliklerini koruyan bir insan eozinofilik lösemi modeli olan EoL-1 hücre hattı kullanılmıştır. EoL-1 hücreleri karakteristik yüzey belirteçlerini ifade eder ve eozinofillerin granül mekanizmasına sahiptir, bu da onları in vitro deneyler için güvenilir ve ölçeklenebilir bir model haline getirir. Dönüştürülmüş hücre hatları birincil eozinofillerin in vivo davranışlarını tam olarak taklit edemese de, EoL-1 kontrollü ve tutarlı bir ortamda moleküler sinyal yolaklarını araştırmak için pratik ve tekrarlanabilir bir sistem sunmaktadır. Bu çalışmada, bir insan eozinofilik lösemi hücre hattı olan EoL-1, eozinofillerin viral mimikriye moleküler düzeyde nasıl yanıt verdiğini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Çalışma özellikle iki kilit hücre içi moleküle odaklandı: NOD benzeri reseptör (NLR) ailesinin bir üyesi olan NOD2 ve adaptör proteini CARD9. Bu moleküller tipik olarak mikrobiyal bileşenlerin doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından tanınmasında ve aşağı akış proinflamatuar sinyal kaskadlarının aktivasyonunda rol oynar. Monositler ve makrofajlardaki rolleri iyi çalışılmış olsa da, eozinofillerdeki ifade şekilleri ve düzenleyici işlevleri belirsizliğini korumaktadır. NOD2 ve CARD9'un eozinofilik bağlamlarda nasıl aktive olduklarını ve antiviral yanıtlara nasıl katkıda bulunduklarını anlamak bu tezin temel amacıdır. EoL-1 hücrelerinde NOD2 ve CARD9 genlerinin ifadesi spesifik siRNA kullanılarak seçici olarak susturulmuş ve hücreler viral ligandlar, TLR7/8 agonisti R848 ve TLR8 agonisti ssRNA40 kullanılarak uyarılmıştır. Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve immünositokimya, 20 nM siRNA'nın her iki geni de mRNA ve protein seviyelerinde downregüle etmek için yeterli olduğunu doğrulamıştır. İlginç bir şekilde, downregülasyondan sonra bile, viral ligandlarla stimülasyon NOD2'nin protein seviyelerinin yükselmesine neden olmuş, bu da transkripsiyon sonrası regülasyonun veya protein stabilizasyonunun azalmış gen ekspresyonunu telafi edebileceğini düşündürmüştür. Bu bulgular, eozinofillerin patojenik sinyallerin varlığında temel doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonlarını sürdürmek veya eski haline getirmek için adaptif sinyal mekanizmalarına sahip olduğunu göstermektedir. Öte yandan, CARD9 ifadesi daha karmaşık bir ifade modeli göstermiştir. siRNA, stimüle edilen gruplar arasında CARD9 mRNA seviyelerini etkili bir şekilde azaltırken, protein ifadesi tutarsız bir şekilde değişmiştir. siRNA ile downregüle olmasına rağmen, ssRNA40 ile muamele edilen hücrelerde CARD9 proteini artmıştır. Bu, eozinofillerdeki potansiyel telafi edici mekanizmaları vurgulamakta veya TLR8 agonistleri tarafından sinyal kaskadlarının seçici aktivasyonunu göstermektedir. Ek olarak, deneyler NOD2'nin CARD9 üzerinde modülatör bir etkisi olduğunu göstermiştir: NOD2'nin siRNA ile susturulması çoğu koşulda CARD9 ifadesini azaltarak NOD2'den CARD9'a tek yönlü bir sinyal ilişkisi olduğunu düşündürmektedir. Bu, diğer bağışıklık hücrelerindeki önceki bulguları desteklemekte ve eozinofillerde bir NOD2-CARD9 ekseninin varlığını önermektedir. Bu moleküler olayların işlevsel sonuçlarını araştırmak için IL-1β salgılanması ELISA kullanılarak değerlendirilmiştir. Deney grupları arasında IL-1β seviyelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir, ancak siRNA ile tedavi edilen örneklerde hafif bir azalma eğilimi gözlemlenmiştir. Bu durum, eozinofillerde IL-1β salgılanmasının bu deneysel bağlamda dahil edilmeyen diğer inflamazom tetikleyicilerine bağlı olduğunu düşündürebilir. Ayrıca, eozinofillerin immünolojik olarak aktif olmalarına rağmen, inflamazom aracılı sitokin üretiminde merkezi oyuncular olmayabileceği veya en azından ATP veya diğer NOD benzeri reseptör aktivatörleri gibi ek uyaranların yokluğunda olmayabileceği hipotezini desteklemektedir. Daha da önemli bir nokta olarak, hücre canlılığı değerlendirmeleri ne siRNA transfeksiyonunun ne de viral stimülasyonun EoL-1 hücrelerinin canlılığını olumsuz etkilemediğini doğrulamıştır. 7-AAD boyama kullanılarak yapılan akış sitometrik analiz, tüm deneysel koşullarda hücre ölümünde önemli bir değişiklik olmadığını ortaya koyarak, gözlemlenen moleküler ve işlevsel farklılıkların sitotoksik etkilerle karıştırılmadığını doğrulamıştır. Bu çalışmanın bulguları bağışıklık aracılı hastalıklar için de önemli çıkarımlar sağlamaktadır. NOD2 mutasyonlarının Crohn hastalığında rol oynadığı ve bağırsak homeostazını ve mikrobiyal algılamayı bozduğu bilinmektedir. Benzer şekilde, CARD9 disfonksiyonu kronik mantar enfeksiyonları, enflamatuar bağırsak hastalığı ve otoimmün bozukluklar ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, bu moleküllerin viral stimülasyon altında eozinofillerde nasıl davrandığının anlaşılması, hem enfeksiyon hem de inflamasyon içeren hastalıkların patogenezi sırasında immün yanıtların modüle edilmesine yönelik gelecekteki stratejiler için yeni bilgiler sağlayabilir. Burada gözlemlenen regülatör dinamikler, eozinofillerin viral patogenez bağlamında kronik immün aktivasyona nasıl katkıda bulunduğu veya çözülmesine nasıl yardımcı olduğu konusunda alternatif yaklaşımlar sağlayabilir. Ayrıca, bu çalışmada EoL-1 hücrelerinin kullanılması, eozinofilik yanıtları analiz etmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir sistem sağlamıştır, ancak bu modelin primer eozinofil biyolojisini tam olarak mimik edemeyebileceği kabul edilmektedir. Bu sınırlamaya rağmen, bu in vitro deneysel yaklaşım, temel doğuştan gelen bağışıklık reseptörleri ve bunların sinyal aracıları arasındaki ifade, düzenleme ve potansiyel etkileşim hakkında değerli veriler sağlamıştır. Bu bulgular, eozinofillerin viral enfeksiyon sırasında pasif seyirciler olmadığı, aktivasyon durumlarına ve stimülasyon bağlamına bağlı olarak düzenleyici veya efektör roller oynayabileceği yönündeki daha geniş hipotezi desteklemektedir. Özetle, bu çalışma NOD2 ve CARD9'un eozinofilik hücrelerde dinamik olarak düzenlendiğini ve viral stimülasyona karmaşık, ortama bağlı bir şekilde yanıt verdiğini göstermektedir. Bu moleküllerin ifadeleri hem siRNA knockdown hem de ligand maruziyeti ile modüle edilir ve aralarında düzenleyici etkileşim olduğuna dair kanıtlar vardır. IL-1β salgılanması önemli ölçüde etkilenmemiş olsa da, veriler eozinofillerin viral unsurları algılamak ve muhtemelen yerel bağışıklık tepkilerini modüle etmek için gerekli sinyal oluşturma mimarisine sahip olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, eozinofil plastisitesinin giderek daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmakta ve bu bulguları doğrulamak için primer eozinofiller veya in vivo modeller kullanılarak daha fazla araştırma yapılması gerektiğini vurgulamaktadır. Sonuç olarak, eozinofillerde NOD2 ve CARD9 sinyalizasyonunun karakterizasyonu, viral enfeksiyonlarda ve eozinofil ile ilişkili bağışıklık bozukluklarında terapötik müdahaleler için yeni yollar ortaya çıkarabilir.

Özet (Çeviri)

Eosinophils are multifunctional immune cells known for their established role in parasitic infections and allergic reactions. However, their emerging contributions to antiviral immunity have recently drawn increasing attention. These granulocytes contain cytoplasmic granules rich in cytotoxic proteins, such as eosinophil cationic protein (ECP), eosinophil-derived neurotoxin (EDN), and major basic protein (MBP), as well as cytokines and chemokines, which may be involved in regulating innate and adaptive immune responses. Moreover, they can act as antigen-presenting cells under specific conditions, contributing to the activation and modulation of T cell-mediated immune responses. These observations have prompted investigations into the potential regulatory pathways that control eosinophil function during viral infections. Due to the low abundance of eosinophils in peripheral blood (typically 1–4% of circulating leukocytes) and their limited viability ex vivo, conducting functional and mechanistic studies on primary eosinophils poses significant technical challenges. To overcome these limitations, this study employed the EoL-1 cell line, a human eosinophilic leukemia model that retains several morphological and immunological features of mature eosinophils. EoL-1 cells express characteristic surface markers and possess the granule machinery of eosinophils, making them a reliable and scalable model for in vitro experimentation. Although transformed cell lines may not fully replicate the behavior of primary eosinophils in vivo, EoL-1 offers a practical and reproducible system for probing molecular signaling pathways in a controlled and consistent environment. In this study, EoL-1, a human eosinophilic leukemia cell line, was used as a model to examine how eosinophils respond to viral mimicry at the molecular level. The study particularly focused on two key intracellular molecules: NOD2, a member of the NOD-like receptor (NLR) family, and the adaptor protein CARD9. These molecules are typically involved in innate immune recognition of microbial components and activation of downstream proinflammatory signaling cascades. Although their roles in monocytes and macrophages have been well studied, their expression patterns and regulatory functions in eosinophils remain unclear. Understanding how NOD2 and CARD9 are activated in eosinophilic contexts, and how they contribute to antiviral responses, was the central aim of this thesis. NOD2 and CARD9 gene expressions in EoL-1 cells were selectively silenced using specific siRNA, and cells were stimulated using viral ligands, TLR7/8 agonist R848 and TLR8 agonist ssRNA40. Quantitative PCR and immunocytochemistry confirmed that 20 nM siRNA was sufficient to downregulate both genes at the mRNA and protein levels. Interestingly, even after knockdown, stimulation with viral ligands resulted in elevated protein levels of NOD2, suggesting that post-transcriptional regulation or protein stabilization might compensate for the reduced gene expression. These findings indicate that eosinophils possess adaptive signaling mechanisms to sustain or restore key innate immune functions in the presence of pathogenic signals. CARD9 expression, on the other hand, showed a more complicated expression pattern. While siRNA effectively reduced CARD9 mRNA levels across treatment groups, protein expression was inconsistently altered. Of note, CARD9 protein increased in cells treated with ssRNA40, despite its knockdown. This highlights potential compensatory mechanisms in eosinophils or indicates selective activation of signalling cascades by TLR8 agonists. Additionally, experiments demonstrated a modulatory effect of NOD2 on CARD9: knockdown of NOD2 reduced CARD9 expression in most conditions, suggesting a unidirectional signalling relationship from NOD2 to CARD9. This supports previous findings in other immune cells and proposes the existence of a NOD2–CARD9 axis in eosinophils. To investigate the functional outcome of these molecular events, IL-1β secretion was assessed using ELISA. No statistically significant changes were observed in IL-1β levels across experimental groups, although a slight reduction was noted in siRNA-treated samples. This might suggest that IL-1β secretion in eosinophils depends on other inflammasome triggers that are not included in this experimental context. Furthermore, it supports the hypothesis that eosinophils, while immunologically active, might not be central players in inflammasome-mediated cytokine production, or at least not in the absence of additional stimuli such as ATP or other NOD-like receptor (NLR) activators. Importantly, cell viability assessments confirmed that neither siRNA transfection nor viral stimulation negatively impacted the EoL-1 cells. Flow cytometric analysis using 7-AAD staining revealed no significant changes in cell death across all experimental conditions, validating that the observed molecular and functional differences were not confounded by cytotoxic effects. The findings of this study also provide important implications for immune-mediated diseases. NOD2 mutations are implicated in Crohn's disease and known to disrupt intestinal homeostasis and microbial recognition. Likewise, CARD9 dysfunction has been linked to chronic fungal infections, inflammatory bowel disease, and autoimmune disorders. Therefore, understanding how these molecules behave in eosinophils under viral stimulation may provide new insights for future strategies for modulating immune responses during pathogenesis of diseases involving both infection and inflammation. The regulatory dynamics observed here could provide alternative approaches for how eosinophils either contribute to or help resolve chronic immune activation in the context of viral pathogenesis. Moreover, the use of EoL-1 cells in this study provided a consistent and reproducible system for analysing eosinophilic responses, though it is acknowledged that this model may not fully mimic primary eosinophil biology. Despite this limitation, this in vitro experimental approach yielded valuable data on the expression, regulation, and potential interaction between key innate immune receptors and their signalling intermediates. These findings support the broader hypothesis that eosinophils are not passive bystanders during viral infection but may play regulatory or effector roles depending on their activation state and the context of stimulation. In summary, this study demonstrates that NOD2 and CARD9 are dynamically regulated in eosinophilic cells and respond to viral mimetic stimulation in a complex, context-dependent manner. Their expression is modulated by both siRNA knockdown and ligand exposure, with evidence of regulatory interplay between them. Although the secretion of IL-1β was not significantly affected, the data suggest that eosinophils possess the signalling architecture required for sensing viral elements and possibly modulating local immune responses. These results contribute to the growing understanding of eosinophil plasticity and highlight the need for further research using primary eosinophils or in vivo models to confirm these findings. Ultimately, the characterization of NOD2 and CARD9 signalling in eosinophils may reveal new avenues for therapeutic interventions in viral infections and eosinophil-associated immune disorders.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    390178

    Nükleotid bağlanma ve oligomerizasyon domeyn 2 (Nod2) gen varyantlarının kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gelişimi ve hastalığın şiddeti üzerine etkisinin araştırılması

    Investigation of the effect of nucleotide binding and oligomerization domain 2 (Nod2) gene variants on development and severity of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)

    FADİME MUTLU İÇDUYGU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    GenetikAfyon Kocatepe Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MÜJGAN ÖZDEMİR ERDOĞAN

  2. Tez No

    628100

    NOD1, NOD2, PYDC1 VE PYDC2 genlerinin behçet hastalığı patogenezine etkisinin araştırılması

    Investigation of the effect of NOD1, NOD2, PYDC1 and PYDC2 genes in the pathogenesis of behçet's disease

    AYÇA KOCAAĞA

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    GenetikZonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AHMET DURSUN

  3. Tez No

    829145

    Investigation of novel genes and functional roles in MEFV negative FMF patients through next-generation sequencing

    MEFV negatif ailesel Akdeniz ateşi hastalarında yeni nesil dizileme yöntemiyle özgün genlerin ve işlevlerinin araştırılması

    MERVE ÖZKILINÇ ÖNEN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI

  4. Tez No

    879718

    Molecular and functional investigation of disease-associated cytoskeletal proteins protrudin and MYO1H

    Hastalık ilişkili sitoskeletal proteinler protrudin ve MYO1H'nin moleküler ve fonksiyonel araştırılması

    ECE SELÇUK ŞAHİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ

  5. Tez No

    414069

    Generation and characterization of familial mediterranean fever (FMF) disease-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs)

    Ailesel Akdeniz ateşi hastalığına spesifik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretimi ve karakterizasyonu

    KEREM FİDAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER

Geri Dön