Psikrotolerant pseudomonas sivasensis R11S16 izolatından yqia/ycfp geninin moleküler klonlanması, heterolog ifadesi, karakterizasyonu ve antibiyotik giderim potansiyelinin araştırılması
Molecular cloning, heterologous expression, characterization and antibiotic removal potential of the yqia/ycfp gene from the psychrotolerant pseudomonas sivasensis r11s16 isolate
- Tez No: 967597
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ALİ OSMAN ADIGÜZEL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biyoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Biology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: DNA-rekombinant, Gen klonlama, Mikrobiyal enzimler, Moleküler karakterizasyon, Moleküler klonlama, Protein ekspresyonu, DNA-recombinant, Gene cloning, Microbial enzymes, Molecular Characterisation, Molecular cloning, Protein expression
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ondokuz Mayıs Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Sunulan bu çalışma kapsamında; Kaçkar dağlarından izole edilerek 16S rRNA gen dizisi temelinde Pseudomonas sivasensis R11S16 olarak tasarlanan psikrotolerant bakteri suşundaki esteraz enzimi kodlama potansiyeli olan yqiA/ycfP genleri pET20b(+) vektörüne klonlanarak E.coli BL21(DE3)'te ifade edilmiştir. Enzim aktivitesi analizlerinde substrat olarak p-nitrofenil bütirat kullanılmıştır. Bir ünite (U) enzim aktivitesi, substrattan dakikada 1 µmol p-nitrofenol salınımına neden olan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Toplam protein miktarı ise Bradford yöntemi ile tahmin edilmiştir. Buna göre, amfisilinli LB besiyerinde 100 mM IPTG varlığında rekombinant molekülü/vektörü barındıran E. coli klonunun 25 °C ve 150 rpm'de 12 saat inkübasyonu ile üretilen enzim miktarı 0,510 U/mL olarak tespit edilmiştir. Histidin etiketi yardımıyla saflaştırılan enzim kısmen karakterize edilmiştir. Enzimin en iyi aktivite gösterdiği sıcaklığın 20 °C, pH'nın ise 9 olduğu tespit edilmiştir. Reaksiyon karışımında %1 NaCl varlığının enzim aktivitesini arttırdığı tespit edilmiş olup, NaCl'nin %16'ya kadar arttırılması enzim aktivitesinde önemli bir düşüşe neden olmamıştır. Metal iyonları arasından; Ba2+, Ca2+, K+, Mg2+ ve Co+2'ın (1 ve 10 mM) enzim aktivitesini arttırdığı, Cu2+, Fe2+ ve Ni2+nin ise azalttığı belirlenmiştir. Sürfektanlar arasından; Tween 20 ve SDS'in 1 ve 10 mM, Triton X-100'ün ise 10 mM konsantrasyonda enzim aktivitesini azalttığı, öte yandan 1 mM Triton X-100'ün aktiviteyi düzenlediği gözlemlenmiştir. Ayrıca; reaksiyon karışımına son konsantrasyonları %10 ya da %30 olacak şekilde etanol, metanol, kloroform, aseton, izopropanol, DMSO ve bütanol ilavesinin enzim aktivitesinde önemli seviyede azalmaya neden olduğu belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, the yqiA/ycfP genes, which has the potential to code for the esterase enzyme in the psychrotolerant bacterial strain isolated from the Kaçkar Mountains and designed as Pseudomonas sivasensis R11S16 based on the 16S rRNA gene sequence, was cloned into the pET20b(+) vector and expressed in E. coli BL21(DE3). In enzyme activity analyses, p-nitrophenyl butyrate was used as the substrate. One unit (U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that causes the release of 1 µmol p-nitrophenol from the substrate per minute. The total protein amount was estimated by the Bradford method. Accordingly, the amount of enzyme produced by incubating the E. coli clone harboring the recombinant molecule in the presence of 100 mM IPTG in ampicillin-containing LB medium at 25 °C and 150 rpm for 12 hours was determined as 0.510 U/mL. The enzyme purified with the help of histidine tag was partially characterized. It was determined that the temperature at which the enzyme showed the best activity was 20 °C and pH 9. It was found that the presence of 1% NaCl in the reaction mixture increased the enzyme activity, and increasing NaCl up to 16% did not cause a significant decrease in the enzyme activity. Among the metal ions; it was determined that Ba2+, Ca2+, K+, Mg2+and Co2+ (1 and 10 mM) increased the enzyme activity, while Cu2+, Fe2+and Ni2+ decreased it. Among the surfactants; it was observed that Tween 20 and SDS at 1 and 10 mM, and Triton X-100 at 10 mM concentrations decreased the enzyme activity, while 1 mM Triton X-100 regulated the activity. In addition; it was determined that the addition of ethanol, methanol, chloroform, acetone, isopropanol, DMSO and butanol to the reaction mixture at final concentrations of 10% or 30% caused a significant decrease in enzyme activity.
Benzer Tezler
- Cellulase-free alkaline xylanase enzim üreticisi Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanaklarının araştırılması
Isolation of cellulase-free xylanase Bacillus sp. strains, enzyme production, characterization and investigation of biotechnological applications
ZELİHA NURDAN SARAÇOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyoteknolojiÇukurova ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BURHAN ARIKAN
- Alkali soğukta aktif proteaz üreticisi Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve enzimin biyoteknolojik kullanım olanakları
Isolation of cold-active alkaline protease Bacillus sp. strains, enzyme production, characterization, determination and their biotechnological applications
NALAN TURUS
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyoteknolojiÇukurova ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BURHAN ARIKAN
- Psikrotolerant Bacillus izolatları tarafından hidrokarbonların parçalanabilirliğinin belirlenmesi
Investigation of hydrocarbon degredation capacity for some psychrotolerant strains of Bacillus genus
FULYA KOLSAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyoteknolojiEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RENGİN ELTEM
- Bazı psikrotolerant Bacillus izolatlarında çeşitli hidrolitik enzimlerin taranması ve yüksek aktivite gösteren izolatların pilot ölçekte spor üretiminin yapılması ve biyoformülasyonu
Screening of various hydrolitic enzymes of some psychrotolerant Bacillus isolates and pilot scale production and bioformulation of the isolate showed highest activity
ZEYNEP AKBAL
Doktora
Türkçe
2011
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RENGİN ELTEM
- Steril olmayan koşullar altında psikrotolerant mayalarla peynir altı suyundan biyolipitlerin üretimi
Production of bio-lipids from whey by psychrotolerant yeasts under non-sterile conditions
AMİR SAGHAFİAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MESUT TAŞKIN