Development and evaluation of DCAS9-based artificial transcription factors for neuroprotection: in vitro and ex vivo studies and in vivo evaluation in the RHOP23H retinitis pigmentosa model
Nöroproteksiyon için DCAS9 tabanlı yapay transkripsiyon faktörlerinin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi: In vitro, ex vivo çalışmalar ve RHOP23H retinitis pigmentosa modelinde in vivo değerlendirme
- Tez No: 972492
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ CAVİT AĞCA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biyomühendislik, Biology, Genetics, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Sabancı Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji, Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Kalıtsal retinal dejenerasyonlar, Retinitis Pigmentosa (RP) dahil olmak üzere, fotoreseptörlerin kademeli kaybına ve görme bozukluğuna yol açmaktadır. Bu çalışma, retinal hücrelerin hayatta kalmasını desteklemek amacıyla CRISPR-dCas9 tabanlı yapay transkripsiyon faktörleri (ATF'ler) kullanılarak endojen nöroprotektif genlerin transkripsiyonel aktivasyonuna dayalı yeni bir gen tedavisi yaklaşımını sunmaktadır. Lif, Cntf, Manf, Fgf2, Bdnf ve Clcf1 gibi temel nöroprotektif faktörlerin kontrollü ve ifadesini sağlamak için çeşitli kılavuz RNA'lar (gRNA'lar) tasarlanmış ve bunlar in vitro, in vivo ve ex vivo modellerde değerlendirilmiştir. Ilk gRNA taraması, Müller glia kaynaklı ve immortilize edilmiş dCas9-VP64 ile dCas9-SPH hücre hatlarında gerçekleştirilmiştir. gRNA ve dCas9 ekspresyonu akış sitometrisi ile doğrulanmıştır. ddPCR analizleri, dCas9-SPH ve dCas9-VP64 tabanlı ATF'ler kullanıldığında, hedef genlerin doza bağımlı olarak yukarı regülasyonunu göstermiştir; bu da terapötik düzeyde gen ifdesina ulaşmada aktivatör gücünün önemini ortaya koymuştur. Bu sonuçlara dayanarak, en etkili gRNA'lar U6 promotörleri altına klonlanarak AAV vektörlerine yerleştirilmiş ve in vivo uygulamalar için viral titreleri belirlenmiştir. Terapötik potansiyelin değerlendirilmesi için, retinosfer kültürleri ve ileri düzey bir transgenik fare modeli (Rho-P23Hki/wt; dCas9-SPHki/wt) kullanılmış; böylece yavaş ilerleyen dejeneratif bir modelde hedefli gen aktivasyonunun analizi mümkün olmuştur. ATF'lerin etkinliği, retinosferlerde floresan görüntüleme ve ddPCR ile değerlendirilmiş ve hedef genlerin belirgin aşırı ifade edildiği görülmüştür; bu da ATF-tabanlı nöroproteksiyonun terapötik bir strateji olarak uygulanabilirliğini desteklemiştir. ATF'lerin in vivo etkinliğini değerlendirmek için Rho-P23Hki/wt; dCas9-SPHki/wt fare modeli kullanılarak AAV enjeksiyonları öncesi ve sonrası floresan görüntüleme ve Optik Koherens Tomografi (OCT) teknikleriyle dejenerasyon ve nöroprotektif etkinin takibi yapılmıştır. OCT görüntülemesi, bu hastalık modelinde retinal incelmenin azaldığını göstermiştir. Ancak bu yapısal koruma fonksiyonel geri kazanımla sonuçlanmamış, bu da ilerideki çalışmalarda hastalık modeli, dozlama stratejileri ve değerlendirme kriterlerinin daha da optimize edilmesi gerektiğini ortaya koymuştur. Genel olarak, bulgularımız CRISPR tabanlı gen aktivasyonu terapileri için esnek ve kontrol edilebilir bir platform ortaya koymaktadır. ATF'ler ve AAV vektörleri kullanılarak endojen nöroprotektif gen ifadesinin doza bağımlı bir şekilde düzenlenebilmesi, gen replasman yaklaşımlarına bir alternatif sunmakta ve kalıtsal retinal hastalıklarda hassas gen düzenleyici tedavilerin önünü açmaktadır.
Özet (Çeviri)
Inherited retinal degenerations, including Retinitis Pigmentosa (RP), cause progressive loss of photoreceptors and vision impairment. This study evaluates a novel gene therapy approach based on transcriptional activation of endogenous neuroprotective genes using CRISPR-dCas9 artificial transcription factors (ATFs) to promote retinal cell survival. We designed and evaluated multiple guide RNAs (gRNAs) to achieve controlled, multiplexed overexpression of key neuroprotective factors, including Lif, Cntf, Manf, Fgf2, Bdnf, and Clcf1, using in vitro, in vivo, and ex vivo models. Initial gRNA screening was performed in Müller glia-derived dCas9-VP64 and dCas9-SPH immortalized cell lines. Expression of gRNA and dCas9 was confirmed by flow cytometry. ddPCR analysis demonstrated dose-dependent upregulation of target genes, using dCas9-SPH and dCas9-VP64-based ATFs, showing the importance of activator strength in achieving therapeutic levels of gene expression. Based on these results, the most effective gRNAs were cloned into AAV vectors under U6 promoters, and viral titers were determined for in vivo delivery. To evaluate therapeutic potential, we utilized retinosphere cultures and an advanced transgenic mouse model (Rho-P23Hki/wt; dCas9-SPHki/wt), which allowed targeted delivery and assessment of gene activation in a slow-degeneration animal model. The efficiency of ATFs was evaluated in retinospheres using fluorescence imaging and ddPCR, which showed distinct overexpression of target genes, supporting the feasibility of ATF-dependent neuroprotection as a therapeutic strategy. To evaluate the in vivo efficiency of ATFs, in the Rho-P23Hki/wt; dCas9-SPHki/wt model, in vivo fluorescent and Optical Coherence Tomography (OCT) imaging techniques were performed before and after AAV injections to follow up the degeneration and the neuroprotective effects of the key neurotrophic factors. OCT imaging showed reduced retinal thinning in this disease model. However, this did not translate into measurable functional recovery, highlighting the need for further optimization of disease model, dosing strategies, and evaluation metrics in future studies. Overall, our findings establish a flexible and controllable platform for CRISPR-based gene activation therapies in retinal disease. The ability to regulate endogenous neuroprotective gene expression in a dose-dependent manner using ATFs and AAV vectors offers an alternative to gene replacement approaches, facilitating the way for precise gene regulatory therapies in inherited retinal disorders.
Benzer Tezler
- Development and evaluation of inter query optimization heuristics in database systems
Veri tabanı sistemlerinde sorgulararası optimizasyon metodlarının geliştirilmesi ve incelenmesi
YİĞİT KULABAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
1996
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiY.DOÇ.DR. ÖZGÜR ULUSOY
- Development and evaluation of a super critical fluid fractionation system: Preliminary studies on fatty acid methyl esters of tomato seed oil
Kritiküstü akışkan ayrıştırma sisteminin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi: Domates çekirdeği yağı yağ asidi metil esterleri üzerine yapılan ön çalışmalar
HATİCE AHUNBAY
Yüksek Lisans
İngilizce
1996
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiPROF.DR. ÖNER HORTAÇSU
Y.DOÇ.DR. MURAT DERVİŞOĞLU
- Development and evaluation of a metrics set for component oriented software engineering
Bileşen tabanlı yazılım mühendisliğine ait bir ölçüt setinin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi
NAEL SALMAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2002
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ALİ DOĞRU
- Development and evaluation of a programmble simulation tool for learning physics
Fizik öğrenimi için programlanabilir simülasyon aracı geliştirilmesi ve değerlendirilmesi
ERKİN TUNCA
Yüksek Lisans
İngilizce
2003
Eğitim ve ÖğretimOrta Doğu Teknik ÜniversitesiOrtaöğretim Fen ve Matematik Alanlar Eğitimi Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. ALİ ERYILMAZ
- Development and evaluation of feedback-based freeway ramp metering strategies
Başlık çevirisi yok
ILGIN YAŞAR
Doktora
İngilizce
2006
İnşaat MühendisliğiRutgers, The State Unıversıty Of New Jersey-New Brunswıck CampusDOÇ. DR. KAAN ÖZBAY