Kereviz bitkisinin yaprak ve sap bölgelerinden fenilalanin amonyum liyaz enziminin afinite kromatografisi ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of phenylalanine ammonia lyase enzyme from the leaf and stem regions of celery plant using affinity chromatography
- Tez No: 989979
- Danışmanlar: PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Apium graveolens L, PAL enzimi, afinite kromatografisi, saflaştırma, Apium graveolens L, PAL enzyme, affinity chromatography, purification
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Genellikle 60–90 cm yüksekliğe ulaşabilen, tek ya da iki yıllık otsu bir bitki olarak yetiştirilen ve Apiaceae (maydanozgiller) familyasına ait olan kereviz (Apium graveolens L.), fenilpropanoid yapıda çeşitli ikincil metabolitler bakımından zengin bir türdür. Fenilpropanoid bileşikleri; lignin, kumarin, flavonoid ve fenolik asitlerin biyosentezinde görev alan önemli bir metabolit sınıfını oluşturmaktadır. Bu bileşiklerin biyosentez yolunda ilk ve hız kısıtlayıcı basamağı katalizleyen Fenilalanin Amonyum Liyaz (PAL) enzimi, L-fenilalanini (L-Phe) trans-sinnamik aside (t-CA) dönüştürerek fenilpropanoid metabolik akışını başlatmaktadır. PAL enzimi patojen saldırıları, UV ışını maruziyeti ve çeşitli çevresel stres faktörlerine karşı bitkinin verdiği biyokimyasal yanıtların odak noktası olduğundan fenolik bileşiklerin sentezlenmesinde etkin rol oynamaktadır. Fenilpropanoid profili yüksek olan kereviz, PAL enziminin önemli bir kaynağı olarak, biyoteknolojik sentezlerde ve terapötik etkili fenolik bileşiklerin üretiminde etkin rol üstlenmektedir. Bu çalışmada, kereviz bitkisinin yaprak ve sap bölgelerinden PAL enzimi izole edilerek afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve biyokimyasal olarak karakterize edilmiştir. PAL enzim aktivitesinin belirlenmesinde 0,4 mM derişimde hazırlanan stok t-CA çözeltisi kullanılarak standart kalibrasyon eğrileri oluşturulduktan sonra absorbans ölçümleri L-Phe substratı ile 290 nm'de yapılmıştır. Enzim miktarının belirlenmesi amacıyla Bovin Serum Albumin (BSA, 1 mg/mL) stok çözeltisinden yararlanılmış ve protein miktarı 595 nm'de ölçülmüştür. Kerevizin yaprak ve sap bölümlerinden elde edilen ham ekstraktlarda spesifik aktivite değerleri sırasıyla 18,83 mM ve 16,35 mM olarak belirlenmiştir. Bu sonuçlar arasında anlamlı bir ilişki kurulabilmesi amacıyla her iki ekstrakt kullanılarak optimum reaksiyon koşulları saptanmıştır. Bu sonuçlar doğrultusunda, PAL aktivitesinin gözlendiği optimum tampon konsantrasyonu, pH ve sıcaklık değerleri yaprak için sırasıyla 0,1 M; 7,2 ve 30 °C; sap için ise 0,1 M; 6,3 ve 30 °C olarak belirlenmiştir. Belirlenen optimum koşullar kullanılarak oluşturulan Lineweaver–Burk grafiği sonucunda L-Phe substratı için Vmax ve KM kinetik parametreleri hesaplanarak, değerler kereviz yaprağı ve sapı için sırasıyla 0,77 mM; 12,16 µM ve 1,32 mM; 33,22 µM olarak bulunmuştur. Bu çalışmada, PAL enzimi Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi uygulanarak kereviz yaprak ve sap örneklerinden başarıyla saflaştırıldı ve PAL enziminin molekül ağırlığı yaklaşık olarak 20 kDa olarak bulundu. Bu çalışmalara ek olarak, PAL enziminin depolama kararlılığı çalışması yapılmış ve kereviz yaprağından saflaştırılan PAL enziminin 3 ay süre sonunda stabilitesini %85,70; kereviz sapından saflaştırılan PAL enziminin ise 3 ay süre sonunda stabilitesini %81,30 oranında koruduğu ortaya konulmuştur. Bu sonuçlar, PAL enziminin potansiyel biyoteknolojik uygulamalarda stabil bir enzim olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Celery (Apium graveolens L.), which is generally grown as an annual or biennial herbaceous plant reaching a height of 60–90 cm and belonging to the Apiaceae family, is a species rich in various secondary metabolites with phenylpropanoid structures. Phenylpropanoid compounds constitute an important class of metabolites involved in the biosynthesis of lignin, coumarin, flavonoids, and phenolic acids. Phenylalanine Ammonium Lyase (PAL), which catalyzes the first and rate-limiting step in the biosynthesis of these compounds, initiates the phenylpropanoid metabolic cascade by converting L-phenylalanine (L-Phe) to trans-cinnamic acid (t-CA). Because the PAL enzyme is the focal point of the plant's biochemical responses to pathogen attacks, UV light exposure, and various environmental stress factors, it plays an active role in the synthesis of phenolic compounds. Celery, with its high phenylpropanoid profile, plays an active role in biotechnological syntheses and in the production of therapeutically effective phenolic compounds, serving as an important source of the PAL enzyme. In this study, PAL enzyme was isolated from celery leaves and stems, purified by affinity chromatography, and biochemically characterized. To determine PAL enzyme activity, standard calibration curves were generated using a 0.4 mM t-CA stock solution, followed by absorbance measurements at 290 nm with L-Phe as the substrate. A 1 mg/mL stock solution of Bovine Serum Albumin (BSA) was used to determine enzyme levels, and protein levels were measured at 595 nm. Specific activity values in crude extracts obtained from the leaves and stems of celery were determined as 18.83 mM and 16.35 mM, respectively. To establish a significant relationship between these results, optimal reaction conditions were determined using both extracts. According to these results, the optimum buffer concentration, pH, and temperature values at which PAL activity was observed were determined as 0.1 M, 7.2, and 30 °C for leaves and 0.1 M, 6.3, and 30 °C for stems, respectively. As a result of the Lineweaver–Burk plot created using the determined optimum conditions, Vmax and KM kinetic parameters for L-Phe substrate were calculated, and the values were found as 0.77 mM, 12.16 µM, 1.32 mM, and 33.22 µM for celery leaves and stems, respectively. In this study, PAL enzyme was successfully purified from celery leaf and stem samples using the Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) method, and the molecular weight of the enzyme was approximately 20 kDa. In addition to these studies, a storage stability study of the PAL enzyme was conducted, and it was shown that the PAL enzyme purified from celery leaves maintained its stability at 85.70% after 3 months, while the PAL enzyme purified from celery stalks maintained its stability at 81.30% after 3 months. These results indicate that the PAL enzyme can be considered a stable enzyme in potential biotechnological applications.
Benzer Tezler
- Erzincan Ergan Dağı yöresinde sebze olarak tüketilen yabani otların morfolojik özelliklerinin ve besin değerlerinin belirlenmesi
Determination of morphological characteristic and nutritional values of wild edible plant consumed as vegetables in Ergan Mountain region in Erzincan
HAZEL NAS
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
ZiraatAtatürk ÜniversitesiBahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ERTAN YILDIRIM
- Mikrobiyal ve inorganik gübre uygulamalarının tuz stresi altında yetiştirilen ıspanak (Spinacia oleracea) ve kök kerevizde (Apium graveolens) bitki gelişimi ve verim üzerine etkisi
Effects of microbial and inorganic fertilizer application on spinach (Spinacea oleracea) and root celery (Apium graveolens) yields parameter and nutrient content grown under salinity stress condition
FERDA AKKUŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
ZiraatAtatürk ÜniversitesiToprak Bilimi ve Bitki Besleme Ana Bilim Dalı
PROF. DR. METİN TURAN
- Gıda olarak tüketilen bazı yeşil otların yem değerinin ve anti-metanojenik özelliklerinin belirlenmesi
Determination of the feed value and anti-methanogenic properties of some green plants as food
NEVİN KILINÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
ZiraatErciyes ÜniversitesiZootekni Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SELMA BÜYÜKKILIÇ BEYZİ
- Kapra böceği Trogoderma granarium (Coleoptera: Dermastidae)'da çinko oksit nanoparçacıklarının insektisit etkinliğinin belirlenmesi
Determination of insecticidal activity of zinc oxide nanoparticles in khapra beetle Trogoderma granarium
HASAN SİVRİKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
ZiraatNecmettin Erbakan ÜniversitesiMoleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ASLI DAĞERİ
DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞBA NUR ASLAN
- Bornova (İzmir) koşullarında çeşitli kültür bitkilerinde zarar yapan Dolycoris baccarum (L.) (Heteroptera: Pentatomidae)'un biyolojisi ve ekolojisi üzerinde araştırmalar
Investigations on the biology and ecology of Dolycoris baccarum (L.) (Heteroptera: Pentatomidae) which attacks to various plants of economic importance at Bornova (İzmir)
YUSUF KARSAVURAN