Geri Dön

Development of antibodies to ROS1 fusion proteins for the diagnosis and treatment research of non-small cell lung cancer

Küçük hücreli dışı akciğer kanserinin tanı ve tedavi araştırmaları için ROS1 füzyon proteinlerine karşı antikor geliştirilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 995553
  2. Yazar: TAOUFIK ALLABABIDI
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. YASEMİN SAYGIDEĞER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Çukurova Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Arka Plan: ROS1 gen füzyonları, özellikle CD74–ROS1 ve EZR–ROS1, küçük hücre dışı akciğer kanseri (NSCLC) hastalarının bir alt grubunda klinik olarak önemli onkojenik sürücülerdir. Bu füzyon proteinleri, sürekli aktif ROS1 kinaz domenini korur ve hem terapötik inhibisyon hem de tanısal antikor geliştirme açısından cazip moleküler hedefler olarak öne çıkar. Amaç: Bu çalışmanın amacı, CD74–ROS1 ve EZR–ROS1 füzyon genlerini içeren ekspresyon vektörlerini oluşturmak ve doğrulamak, bu genlerin memeli hücre sistemlerinde geçici (transient) ve kalıcı (stable) ekspresyonunu değerlendirmek, rekombinant proteinleri saflaştırmak ve antikor üretimi için potansiyel aday olarak doğrusal B-hücresi epitoplarını tahmin etmektir. Yöntemler: Kodonu memeli ekspresyonuna optimize edilmiş CD74–ROS1 ve EZR–ROS1 genleri, His-etiketi içeren pcDNA3.1(+) vektörlerine klonlandı ve dizileme ile doğrulandı. Geçici transfeksiyonlar HEK293T, A549 ve Calu-1 hücrelerinde gerçekleştirildi. Protein ekspresyonu Western blot ile analiz edildi ve His-etiketli proteinler Ni-NTA yöntemiyle saflaştırıldı. Kalıcı hücre hatları G418 ile seçildi. Füzyon birleşim bölgelerine yakın B-hücresi epitopları, BepiPred-2.0 aracıyla tahmin edildi. Bulgular ve Sonuç: Her iki füzyon geni de başarıyla pcDNA3.1 vektörlerine klonlandı ve beklenen büyüklükte ekzonlar elde edildi (CD74–ROS1: 2121 bp; EZR–ROS1: 2586 bp). HEK293T hücrelerine yapılan geçici transfeksiyon sonucunda füzyon proteinlerinin ifadesi tespit edildi; CD74–ROS1, EZR–ROS1'e kıyasla daha yüksek ve daha stabil ekspresyon düzeyleri gösterdi. Özellikle, EZR–ROS1, kısmi proteolitik yıkıma rağmen, Ni-NTA afinitesi ile saflaştırma açısından daha uygun olduğu görüldü. CD74–ROS1'in A549 ve Calu-1 hücre hatlarında stabil ekspresyonunu sağlama girişimleri, hem standart hem de azaltılmış G418 konsantrasyonlarında başarısız oldu. Plazmid entegrasyonu doğrulanmasına rağmen, dirençli klonlarda protein ifadesi tespit edilemedi; bu durum, olası bir onkogen kaynaklı sitotoksisiteyi veya epigenetik sessizleşmeyi düşündürmektedir ve muhtemelen stabil CD74–ROS1 eksprese eden hücre hatlarının oluşturulamaması ya da sessizleşmesiyle sonuçlanmıştır. B-hücresi epitop tahmin analizleri, füzyon bölgelerinde yüksek immünojenik özelliklere sahip iki lineer epitopu tanımladı: KPTDAPPKDDFWIPE (CD74–ROS1; amino asit 200–215) ve KTKKAERDDFWIPETSFI (EZR–ROS1; amino asit 356–373).

Özet (Çeviri)

Background: ROS1 gene fusions, particularly CD74–ROS1 and EZR–ROS1, are clinically significant oncogenic drivers in a subset of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. These fusion proteins retain the constitutively active ROS1 kinase domain and represent attractive molecular targets for both therapeutic inhibition and diagnostic antibody development. Objective: This study aimed to construct and validate expression vectors encoding CD74–ROS1 and EZR–ROS1 fusion genes, assess their transient and stable expression in mammalian cell systems, purify the recombinant proteins, and predict linear B-cell epitopes as potential candidates for antibody generation. Methods: Codon-optimized CD74–ROS1 and EZR–ROS1 genes were cloned into pcDNA3.1(+) vectors with a His-tag and verified by sequencing. Transient transfection was performed in HEK293T, A549, and Calu-1 cells. Protein expression was analyzed by Western blotting, and His-tagged proteins were purified via Ni-NTA. Stable cell lines were selected with G418. B-cell epitopes near fusion junctions were predicted using BepiPred-2.0 Results& Conclusion: Both fusion genes were successfully cloned into pcDNA3.1 vectors, producing inserts of the expected sizes (CD74–ROS1: 2121 bp; EZR–ROS1: 2586 bp). Transient transfection in HEK293T cells resulted in detectable expression of the fusion proteins, with CD74–ROS1 displaying higher and more stable expression levels than EZR–ROS1. Notably, EZR–ROS1 proved more suitable for Ni-NTA affinity purification, although partial proteolytic degradation was observed. Attempts to establish stable expression of CD74–ROS1 in A549 and Calu-1 cell lines were unsuccessful, even under both standard and reduced concentrations of G418. Although plasmid integration was confirmed, no protein expression was detected in resistant clones, suggesting possible oncogene-induced cytotoxicity or epigenetic silencing, which likely contributed to either the inability to generate or the silencing of stable CD74–ROS1-expressing cell lines. B-cell epitope prediction identified two highly immunogenic linear epitopes at the fusion junctions: KPTDAPPKDDFWIPE (CD74–ROS1; residues 200–215) and KTKKAERDDFWIPETSFI (EZR–ROS1; residues 356–373).

Benzer Tezler

  1. Tez No

    799447

    Vascular function in chronic end-organ damage: pharmacological characterization of vasomotor function in systemic vasculature

    Kronik uç-organ hasarında vasküler fonksiyon: Sistemik damarlarda vazomotor fonksiyonun farmakolojik karakterizasyonu

    NADİR ULU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Eczacılık ve FarmakolojiUnıversıty Of Gronıngen (rıjksunıversıteıt Gronıngen)

    Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ROBERT HENK HENNING

  2. Tez No

    977353

    Development of systems to produce antibodies to target tumor-stroma crosstalk

    Tümör-stroma etkileşimini hedef alan antikorlar üretmek için sistemlerin geliştirilmesi

    ÖMRÜM NAZ NALKIRAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. DEVRİM GÖZÜAÇIK

    DR. YUNUS AKKOÇ

  3. Tez No

    149953

    İnsan immünoglobülin G'sine karşı monoklonal antikor elde edilmesi

    Development of monoclonal antibodies specific to human immunoglobuling G

    ASLI ÜNSAL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2005

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DOÇ. DR. ÖZLEM UĞUR

  4. Tez No

    831494

    İmmün kontrol noktası PD-L1 proteinini bloke edici monoklonal antikorların geliştirilmesi

    Development of blocking monoclonal antibodies to the immune checkpoint PD-L1 protein

    DURMUŞ AKDOĞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TAMER YAĞCI

  5. Tez No

    927033

    Canine Parvovirus-2'ye spesifik IgG antikorlarının tespitinde kullanılacak rekombinant VP2 kapsit proteininin eldesi ve indirekt ELISA sisteminin geliştirilmesi

    Expression of recombinant VP-2 capsid protein to detect IgG antibodies specific for CPV-2 and development of an indirect ELISA system

    EZGİ SALMANLI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Veteriner HekimliğiAnkara Üniversitesi

    Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET TANER KARAOĞLU

Geri Dön