Canine Parvovirus-2'ye spesifik IgG antikorlarının tespitinde kullanılacak rekombinant VP2 kapsit proteininin eldesi ve indirekt ELISA sisteminin geliştirilmesi
Expression of recombinant VP-2 capsid protein to detect IgG antibodies specific for CPV-2 and development of an indirect ELISA system
- Tez No: 927033
- Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET TANER KARAOĞLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Veteriner Hekimliği, Veterinary Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 114
Özet
Canine Parvovirus-2 (CPV-2), köpeklerin, akut hemorajik enterit veya miyokardit ile seyreden en önemli patojen viruslarından biridir. Hastalığın mortalitesi erişkinlerde %10 olmakla beraber, genç köpeklerde mortalite oranı %91'e varabilmektedir. Enfeksiyon yüksek derecede bulaşıcı ve genellikle de ölümcül bir hastalık tablosuna yol açmaktadır. Hastalığın dünyada hala sık görülme sebepleri arasında maternal antikorların varlığının ve düzeyinin bilinmeden yapılan aşılamalar ön sırada yer almaktadır. VP2 proteininin parvoviruslar arasında korunmuş olması ve spesifitesi sebebiyle potansiyel teşhis antijeni olarak kabul edilmiştir. Bu çalışmada; köpeklerde parvovirusa spesifik antikor tespitinin yapılması amacıyla literatürde ilk kez E. coli'den elde edilen tam uzunlukta CPV-2b VP-2 ile rekombinant protein temelli ELISA test sistemi geliştirilmiş, testin detaylı optimizasyonu yapılmış ve analitik performansı değerlendirilmiştir. Bu amaçla; saha izolatından elde edilen VP2 kapsit proteini bölgesi E. coli prokaryotik ekspresyon sisteminde üretilmiş ve elde edilen rVP2 proteini CPV-2 antikorlarının tespiti amacıyla geliştirilecek ELISA sisteminde antijen olarak kullanılmıştır. Checker Board Titrasyon metodu ile optimal kaplama antijeni miktarına 7,5 ug/ml olarak karar verilmiştir. Serum nokta titrastonu yapılarak optimal sulandırma değeri 1:300 olarak belirlenmiştir. Geliştirilen ELISA'nın bağıl sensivite ve bağıl spesifitesinin belirlenmesi için altın standart kabul edilen HI testi ile kıyaslananan klinik çalışması yapılmıştır. Bu amaçla ilk etapta kullanılacak domuz eritrosit süspansiyonu kullanılarak virus HA testine tabi tutularak titresi belirlenmiştir. Sahadan toplanan serum örnekleriyle yapılan HI testinde 1:40 ve altı koruyucu olmayan antikor titresi olarak kabul edilmiştir. Serum örnekleri gruplanmış, geliştirilen ELISA ile değerlendirilmiş ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Negatif serum pleytinde OD450NegAvg + 2XSD değeri ön tanısal negatif cut-off 0,263'tür. Çalışmamızda negatif örneklerin ODmax değeri 0,266 bulunmuştur ve cut-off üzerindeki değerler seropozitiftir. Geliştirilen testin sensivitesi %91,6, spesifitesi %73,3, uyumluluk ise %81,4 olarak hesaplanmıştır. Test altın standart metot ile iyi bir uyumluluk göstermiştir. Çalışmamızda kapsamlı şekilde optimize edilmiş, hatalara açık olmayan hızlı ve düşük maliyetli bir ELISA sistemi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Geliştirilen ELISA sisteminde, CPV-2 antikorunun varlık yokluk tayinin yanında amaçlanan aşılama yapılabilecek zaman aralığı hakkında fikir verebilecek OD cut-off aralığı da değerlendirilmiştir. Yapılan sıklık dağılımı analizinde seronegatif ve seropozitif popülasyonun birbiri ile içiçe geçtiği aralık OD450 0,26-0,30 olarak bulunmuştur. Bu bölge gri bölge olarak değerlendirilip düşük antikor titreli aşı endike olmayan popülasyonu gösterebilmektedir. Çalışmamızda Canine Parvovirus-2 antikorlarını altın standarda kıyasla iyi bir korelasyon, sensivite ve spesifitede tespit edebilecek bir yeni bir ELISA sistemi ve prosedürü geliştirilmiştir. E. coli sisteminde üretilen VP-2 ile geliştirilen ELISA'nın günümüzdeki metotlara kıyasla az maliyetli, kolay üretilebilen ve hızlı bir alternatif olacağı düşünülmektedir. Bulgularımız aşı başarısızlıklarının ve fazla aşılamanın önüne geçmek, epidemiyolojik çalışmalarda kullanımına imkân sağlamak, aşılama sonrası gelişen antikorların takibini yapabilecek bir alternatif olarak güvenilir bir araç olarak kullanılabilmesi açısından umut vadetmektedir.
Özet (Çeviri)
Canine Parvovirus-2 (CPV-2), one of the most important pathogenic viruses in dogs, characterized by acute hemorrhagic enteritis or myocarditis. The mortality rate of the disease is around 10% in adults, but can reach up to 91% in young dogs. The infection is highly contagious and generally leads to a fatalities Among the reasons why the disease is still frequently seen worldwide, vaccinations carried out without knowledge of the presence and level of maternal antibodies are at the forefront. The preservation of the VP2 protein across parvoviruses and its specificity have made it a potential diagnostic antigen. In this study, for the first time in the literature, a full-length CPV-2b VP-2 recombinant protein-based ELISA test system was developed from E. coli to detect specific antibodies to parvovirus in dogs. The test was thoroughly optimized, and its analytical performance was evaluated. For this purpose, the VP2 capsid protein region obtained from field isolate was produced in the E. coli prokaryotic expression system, and the resulting rVP2 protein was used as an antigen in the ELISA system developed for the detection of CPV-2 antibodies. The optimal coating antigen concentration was determined as 7.5 ug/ml using the Checker Board Titration method. The optimal dilution value was determined as 1:300 by serum endpoint titration. A clinical study comparing the developed ELISA's relative sensitivity and relative specificity to the gold standard HI test was conducted. For this purpose, the virus was subjected to the HA test using pig erythrocyte suspension to determine its titer. The virus titer determined by the HA test was used in the HI test at a 4HB value. In the HI test conducted with serum samples collected from the field, a titer of 1:40 or lower was considered non-protective antibody titers. Serum samples were grouped, evaluated with the developed ELISA, and the results were compared. The pre-diagnostic negative cut-off value for OD450NegAvg + 2XSD in negative serum plates was 0.263. In our study, the ODmax value for negative samples was found to be 0.266, and values above the cut-off were considered seropositive. The sensitivity of the developed test was calculated as 91.6%, specificity as 73.3%, and the overall agreement as 81.4%. The test showed good agreement with the gold standard method. In our study, a comprehensively optimized, rapid, and cost-effective ELISA system that is less prone to errors was aimed to be developed. In the developed ELISA system, in addition to determining the presence or absence of CPV-2 antibodies, the OD cut-off range, which could provide an idea about the interval suitable for vaccination, was also evaluated. The frequency distribution analysis revealed an overlapping range between seronegative and seropositive populations, with the range of OD450 0.26-0.30. This region was considered a gray area and may indicate a population with low antibody titers, not suitable for vaccination. In our study, a new ELISA system and procedure capable of detecting Canine Parvovirus-2 antibodies with good correlation, sensitivity, and specificity compared to the gold standard have been developed. The ELISA developed with VP-2 produced in the E. coli system is expected to be a low-cost, easily producible, and rapid alternative compared to current methods. Our findings hold promise as a reliable tool that could help prevent vaccination failures and over-vaccination, facilitate use in epidemiological studies, and serve as an alternative for monitoring seroconversion after vaccination.
Benzer Tezler
- Canine parvovirus enfeksiyonlarının teşhisinde PCR, elısa ve hızlı testin karşılaştırılması
Comparative diagnosis of canine parvovirus with methods of PCR, elisa and rapid test
IRMAK DİK
Doktora
Türkçe
2017
Veteriner HekimliğiSelçuk ÜniversitesiViroloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ATİLLA ŞİMŞEK
- Parvoviral enteritisli köpeklerde sistolik ve diyastolik fonksıyonlar; Longitudinal çalışma
Systolic and diastolic functions in dogs with canine parvoviral enteritis; Longitudinal study
MEHMET EGE İNCE
Doktora
Türkçe
2017
Veteriner HekimliğiSelçuk Üniversitesiİç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KÜRŞAD TURGUT
- Canine Parvovirus-2 ile doğal enfekte köpeklerin klinik ve hematolojik verileri ile hastalık prognozu arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi
Evaluation of the relationship between clinical-hematological data and disease prognosis in dogs naturally infected with Canine Parvovirus-2
FATİH AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
Veteriner HekimliğiAydın Adnan Menderes ÜniversitesiVeterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET TOLGA TAN
- Türkiye'nin Erzurum ilinde köpeklerde parvovirüs enfeksiyonunun prevalansı ve risk faktörlerinin araştırılması
Investigation of the prevalence and risk factors of parvovirus infection in dogs in Erzurum city, Turkey
WALIED FADULALSEED AHMED ISMAIL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
İç HastalıklarıAtatürk Üniversitesiİç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BAŞAK HANEDAN
- Şanlıurfa ilinde yavru köpeklerin ishal olgularında parvovirusların araştırılması
Investigation of parvoviruses in diarrhea cases of puppies i̇n Şanliurfa province
MEHMET SİNAN AKDOĞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Veteriner HekimliğiHarran ÜniversitesiViroloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET ÇABALAR