Geri Dön

Multifunctional glycan–gold nanoparticle conjugates as DC–SIGN targeted nanomedicine against viral infection

Viral enfeksiyona karşı DC–SIGN hedefli nanoilaç olarak çok işlevli glikan-altın nanopartikül konjugatları

PDF İndir

  1. Tez No: 1014125
  2. Yazar: RAHMAN BAŞARAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. DEJIAN ZHOU, DOÇ. DR. YUAN GUO
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Kimya, Biology, Biotechnology, Chemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Unıversıty Of Leeds
  10. Enstitü: Yurtdışı Enstitü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Nanobiyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Çok değerlikli protein-karbonhidrat etkileşimleri birçok biyolojik süreçte, özellikle de sonunda enfeksiyona yol açan patojen-konakçı hücre temaslarının başlatılmasında büyük önem taşımaktadır. Bu etkileşimlerde kullanılan bağlanma yapılarının ve modellerinin açıklığa kavuşturulması, HIV (insan immün yetmezlik virüsü), Ebola virüsü ve son zamanlarda SARS-CoV-2 (şiddetli akut solunum yolu sendromu koronavirüsü - 2) gibi ölümcül viral enfeksiyonlara karşı spesifik ve güçlü çok değerlikli inhibitörlerin tasarımında önemli bir rol oynayacaktır. Ancak, bazı önemli multivalent protein-karbonhidrat etkileşimlerinin temelini oluşturan yapısal mekanizmalar, bu karmaşık, multimerik ve esnek hücre zarı proteinleri için ayrıntılı yapısal bilgi eksikliğinden dolayı hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma esas olarak, birbiriyle yakından ilişkili bir çift glikan bağlayıcı tetramerik lektin proteinleri DC-SIGN ve DC-SIGNR'nin (bundan sonra birlikte DC-SIGN/R olarak kısaltılacaktır) bağlanma özelliklerinin ve yapısal mekanizmalarının açıklığa kavuşturulmasına odaklanmaktadır. Her iki DC-SIGN/R de, virüsün T hücrelerine bulaşmasına aracılık etmek için viral yüzey zarflarında bulunan yüksek mannoz içeren glikanların spesifik olarak tanınmasıyla virüs enfeksiyonlarının kolaylaştırılmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu projenin ana hedefleri, DC-SIGN/R aracılı virüs enfeksiyonlarına karşı spesifik ve güçlü çok değerlikli inhibitörler geliştirmek için bu proteinlerin çok değerlikli glikanlarla bağlanma modlarını ve mekanizmalarını anlamaktır. Burada, glikan kaplı altın nanoparçacıklar (GNP-glikanlar), DC-SIGN/R tabanlı çok değerlikli protein-glikan etkileşimleri için yeni yapısal ve biyofiziksel problar olarak tasarlanmış ve üretilmiştir. DC-SIGN/R ile bağlanma afiniteleri, GNP'lerin mükemmel floresan söndürme özelliğinden yararlanılarak yeni bir floresans söndürme tekniği ile ölçülmüştür. Ayrıca, DC-SIGN/R ile bağlanma modları, bağlanma kaynaklı protein-GNP düzeneklerinin hidrodinamik boyutunu ölçen dinamik ışık saçılımı ve GNP-protein düzeneklerini doğal dağılımlarında görselleştiren“cryo-snapchat”S/TEM görüntüleme yoluyla ortaya koyulmuştur. Son olarak, GNP-glikanların hücre yüzeyi DC-SIGN/R aracılı psödo-Ebola virüsü hücresel enfeksiyonlarını bloke etme potansiyelleri de izlenmiş ve çözünür DC-SIGN/R molekülleri ile onların bağlanma afiniteleri doğrulanmıştır. Bölüm 2'de, üç farklı boyuttaki (örneğin 5, 13 ve 27 nm) GNP'ler sentezlenmiş ve DC-SIGN/R-glikan çok değerlikli bağlanma mekanizmalarını araştırmak üzere çok değerlikli GNP-glikanları oluşturmak için yapı iskeleleri olarak kullanılmıştır. Bir dizi lipoik asit-oligo(etilen glikol) bazlı glikan ligandları (LA-EGn-Man/-DiMan, n = 2 ve 4 ve LA-EG2-ManA pozitif DC-SIGN/R bağlayıcı ligandlar olarak ve LA-EGn-OH, n= 2 ve 4, negatif kontroller olarak) başarıyla sentezlenmiş, saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bir dizi lipoik asit-poli(etilen glikol) bazlı ligandlar (LA-(PEG1000-OH)n, n= 1, 2 ve 3, LA-PEG600-OH ve LA-PEG750-OMe) da sentezlenmiştir. Bölüm 3'te, LA-EGn-glikan ligandları, sağlam, kompakt ve çok değerlikli GNP-glikanları hazırlamak için ligand değişimi yoluyla sitratla stabilize edilmiş GNP'leri kaplamak için kullanılmıştır. Bunların floresans boya etiketli DC-SIGN/R ile bağlanma afiniteleri, protein floresansının bağlanma ile indüklenen söndürülmesinden ölçülmüştür. Önemli sonuçlar elde edilmiştir. İlk olarak, GNP iskele boyutunun arttırılması, DC-SIGN/R ile bağlanma afinitesini arttırmıştır. Örneğin, G27-DiMan her iki DC-SIGN/R'ye (Kds: DC-SIGN için 0,2 nM ve DC-SIGNR için 0,54 nM) daha küçük Gx-DiMan (x=5 ve 13 nm) muadillerine göre daha güçlü bir şekilde bağlanmıştır, örn: DC-SIGN için sırasıyla Kds 5,8 ve 1,0 nM ve DC-SIGNR için Kds 14,9 ve 2,7 nM'dır. Bu, daha büyük bir GNP iskelesinin, DC-SIGN/R'ye bağlanmada yüzey glikanları için daha iyi uzamsal ve yönlendirme eşleşmeleri sunduğunu göstermektedir. İkinci olarak, yüksek bir glikan yoğunluğu her iki DC-SIGN/R ile GNP-glikan bağlanmasını güçlendirmektedir. Üçüncüsü, bağlayıcı uzunluğunun, özellikle daha küçük GNP iskeleleri için, DC-SIGN/R ile GNP-glikan bağlanması üzerinde de önemli bir etkisi olmuştur. Ayrıca, DC-SIGN/R ve GNP-glikan arasındaki bağlanma termodinamiklerini ölçmek için yeni bir floresan söndürme yöntemi geliştirilmiştir. DC-SIGN bağlanmasının, önemli entropi cezaları ile entalpi güdümlü olduğu bulunmuştur. DC-SIGNR'de ise bağlanma, küçük bir olumlu entropik katkı ile telafi edilmesine rağmen, bağlanma entalpik katkısı azaltılmıştır. Ayrıca GNP-glikanların, konakçı hücrelerin DC-SIGN/R aracılı psödo-Ebola virüsü enfeksiyonunu güçlü bir şekilde engellediği bulunmuştur. Örneğin, G27-EG4-DiMan, DC-SIGN ve DC-SIGNR aracılı virüs enfeksiyonlarına karşı sırasıyla 23±1 pM ve 49±2 pM gibi oldukça düşük IC50 değerleri sergilemiştir ve bu da onu şimdiye kadar bildirilen en güçlü GNP-glikan bazlı Ebola virüs inhibitörü yapmıştır. Bölüm 4'te, bağlanma kaynaklı floresans sönümü ve GNP-lektin komplekslerinin hidrodinamik boyutlarını izlemek için floresans söndürme ve dinamik ışık saçılımı yoluyla DC-SIGN/R'nin GNP-glikanlarla bağlanmasının pH bağımlılığını inceledik. GNP-glikanlarla her iki DC-SIGN/R bağlanmasının pH'a bağımlı olduğu ortaya konulmuştur: DC-SIGN bağlanması pH 7.4'ten 6.0'a kadar genel olarak kararlılık sergilerken (sürekli söndürme), DC-SIGNR için bu artış göstermiştir, ancak her ikisinin de bağlanması pH 6.0-4.6 aralığında azalmıştır. Her iki DC-SIGN/R-GNP-glikan bağlanmasının pH'a bağlı bir şekilde tersine çevrilebilir olduğu da ortaya koyulmuştur. Bölüm 5'te, değişen PEG uzunluğu ve yoğunluğuna sahip çeşitli LA-PEG-ligandları ile kaplı GNP'lerin yüzeyindeki protein korona oluşumunu incelemek ve miktarını belirlemek için yeni bir floresan söndürme yöntemi kullanılmıştır. Hedef olmayan proteinler BSA (Bovine Serum Albumin) ve Lys'in (Lysozyme), yüksek Kd değerlerine sahip bu tür GNP-PEG konjugatlarıyla, özellikle de ultra küçük altın nanoküme yapı iskelesi üzerinde oluşturulanlarla, düşük bağlanma afiniteleri sergiledikleri gözlenmiştir. Bu proteinler, bu tür PEG'lenmiş GNP'ler üzerinde kararlı protein korona katmanları oluşturmamıştır, bu da GNP'lerin LA-PEG ligandları ile kaplanmasının spesifik olmayan protein etkileşimlerini önlemede oldukça etkili olduğunu göstermektedir.

Özet (Çeviri)

Multivalent protein-carbohydrate interactions are of great importance in many biological processes, particularly in initiating pathogen-host cell contacts, which ultimately lead to infection. Elucidating the binding structures and patterns used within these interactions will play a key role in the design of specific and potent multivalent inhibitors against deadly viral infections such as HIV (human immunodeficiency virus), Ebola virus, and recently SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2). However, the underpinning structural mechanisms of some important multivalent protein-sugar interactions are still poorly understood, due to a lack of detailed structural information for these complex, multimeric and flexible cell membrane proteins. This work mainly focuses on elucidating the binding characteristics and structural mechanisms of two glycan binding proteins, DC-SIGN and DC-SIGNR (collectively abbreviated as DC-SIGN/R hereafter), a pair of closely related tetrameric lectins. Both DC-SIGN/R play a crucial role in facilitating virus infections by specific recognition of the high-mannose-containing glycans found on the viral surface envelopes to mediate the transmission of the virus to T cells. The key goals of this project are to understand the binding modes and mechanisms of these proteins with multivalent glycans so as to develop specific and potent multivalent inhibitors against DC-SIGN/R-mediated virus infections. Here, glycan coated-gold nanoparticle (GNP-glycans) are designed and produced as new structural and biophysical probes for DC-SIGN/R-based multivalent protein-glycan interactions. Their binding affinities with DC-SIGN/R are quantified through a new fluorescence quenching technique, taking the advantage of the GNP's excellent fluorescence quenching property. Moreover, their binding modes with DC-SIGN/R are revealed via dynamic light scattering and“cryo-snapshot”S/TEM imaging which measure the hydrodynamic size of binding induced protein-GNP assemblies and visualise the GNP-protein assemblies in their native dispersion state, respectively. Finally, the potencies of GNP-glycans in blocking cell surface DC-SIGN/R-mediated pseudo-Ebola virus cellular infections are also pursued and corrected to their solution binding affinity with soluble DC-SIGN/R molecules. Chapter 2, GNPs of three different sizes (e.g. 5, 13 and 27 nm) were synthesised and employed as scaffolds to build up multivalent GNP-glycans to probe DC-SIGN/R-glycan multivalent binding mechanisms. A series of lipoic acid-oligo(ethylene glycol)-based glycan ligands (LA-EGn-Man/-DiMan, where n = 2 and 4, and LA-EG2-ManA, as positive DC-SIGN/R binding ligands) as well as LA-EGn-OH (where n= 2 and 4, as negative controls) are successfully synthesised, purified, and characterised. A series of lipoic acid-poly(ethylene glycol)-based ligands (LA-(PEG1000-OH)n, where n= 1, 2, and 3, LA-PEG600-OH, and LA-PEG750-OMe) were also synthesised. Chapter 3, the LA-EGn-glycan ligands were used to coat citrate-stabilised GNPs via ligand exchange to prepare robust, compact, and multivalent GNP-glycans. Their binding affinities with fluorescent dye-labelled DC-SIGN/R were quantified from binding-induced quenching of the protein fluorescence. Significant results were obtained. First, increasing the GNP scaffold size enhanced the binding affinity with DC-SIGN/R. For instance, G27-DiMan bound more strongly to both DC-SIGN/R (Kds: 0.2 nM for DC-SIGN, and 0.54 nM for DC-SIGNR) than its smaller Gx-DiMan (x=5 and 13 nm) counterparts, e.g. Kds: 5.8 and 1.0 nM for DC-SIGN, and 14.9 and 2.7 for DC-SIGNR, respectively. This indicates that a larger GNP scaffold offers better spatial and orientation matches for surface glycans in binding to DC-SIGN/R. Second, a high glycan density strengthens GNP-glycan binding with both DC-SIGN/R. Third, the linker length also had a significant impact on GNP-glycans binding with DC-SIGN/R, particularly for smaller GNP scaffolds. Moreover, a new fluorescence quenching method has been developed to quantify the binding thermodynamics between DC-SIGN/R and GNP-glycan. DC-SIGN binding was found to be enthalpy-driven with significant entropy penalties. Whereas in DC-SIGNR, the binding enthalpic contribution was reduced, although the binding was compensated with a small favourable entropic contribution. Furthermore, GNP-glycans were found to potently block DC-SIGN/R-mediated pseudo-Ebola virus infection of host cells. For example, G27-EG4-DiMan exhibited the remarkably low IC50 values of 23±1 pM and 49±2 pM against DC-SIGN- and DC-SIGNR-mediated virus infections, respectively, making it the most potent GNP-glycan based Ebola viral inhibitor ever reported. Chapter 4, we studied the pH dependency of the DC-SIGN/R binding with GNP-glycans through fluorescence quenching and dynamic light scattering to monitor binding induced fluorescence quenching and hydrodynamic sizes of GNP-lectin complexes. Both DC-SIGN/R binding with GNP-glycans were pH-dependent: DC-SIGN binding was broadly stable (constant quenching) from pH 7.4 to 6.0, while that increased for DC-SIGNR, however, their bindings were both reduced from pH 6.0 to 4.6. Both DC-SIGN/R-GNP-glycans bindings were reversible in a pH-dependent manner. Chapter 5, a new fluorescence quenching method was employed to study and quantify the protein corona formation on GNP-capped with various LA-PEG-ligands of varying PEG length and density. Non-target proteins, BSA (Bovine Serum Albumin) and Lys (Lysozyme), were observed to exhibit low binding affinities with such GNP-PEG conjugates with high Kd values, especially those constructed on ultra-small gold nanocluster scaffold. These proteins did not form stable protein corona layers on such PEGylated GNPs, showing that coating GNPs with LA-PEG ligands is highly effective in resisting non-specific protein interactions.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    966289

    Investigation of glycan profiles of lactoferrins from different bovine breeds

    Farklı sığır ırklarından elde edilen laktoferrinin glikan profillerinin araştırılması

    RÜYA SESSİZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    BiyoteknolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SERCAN KARAV

  2. Tez No

    420275

    Modification of graphene oxide as efficient catalyst support for polymer electrolyte membrane fuel cells

    Pem yakıt hücreleri için kullanılan graphen oksit kataliz destek malzemenin modifiye edilmesi

    ESAAM JAMİL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    KimyaSabancı Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SELMİYE ALKAN GÜRSEL

  3. Tez No

    494880

    Biyoteknolojik yöntemlerle Basidiomycetes türü mantarlardan fonksiyonel ürünlerin eldesi

    Production of functional products from fungi belonging to the Basidiomycetes sp with biotechnological methods

    EROLL BYTYQI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Gıda MühendisliğiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. BARÇIN KARAKAŞ BUDAK

  4. Tez No

    768182

    Accurate free energy calculations for dolvation of small molecules; and HBGAs binding to human norovirus-VP1 protein using QM, MD and ML-MD methods

    QM, MD ve ML-MD metotlarını kullanarak küçük moleküllerin hassas çözünme serbest enerji ve HBGA'ların insan Norovirüs-VP1 proteinine bağlanma hesaplamaları

    MÜTESİR TEMEL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    KimyaGebze Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AZİZ TANRISEVEN

    DOÇ. DR. ABDULKADİR KOÇAK

  5. Tez No

    942050

    Characterisation of Escherichia coli fimbrial and autotransporter adhesins

    Escherichia coli Türüne ait Fimbrial ve Autotransporter Tipi Adezinlerin Özelliklerinin Belirlenmesi

    TUĞÇE ÖNÜR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyokimyaUnıversıty Of Queensland

    Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MARK SCHEMBRİ

    DR. MİNH-DUY PHAN

Geri Dön