Lakkaz Enziminin Rekombinant Üretimi ve Farklı Substratlarla Renk Oluşturma Potansiyelinin Araştırılması
Laccase Enzyme Recombinant Production and Investigation of Color FormationPotential with Different Substrates
- Tez No: 1021922
- Danışmanlar: PROF. DR. MURAT UYGUN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biochemistry, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Bu çalışmada, Bacillus subtilis kaynaklı CotA lakkaz enziminin Escherichia coli BL21(DE3) ekspresyon sisteminde rekombinant olarak üretilmesi, HPLC-IMAC/Ni-NTA yaklaşımıyla hedef protein saflaştırılması, temel biyokimyasal özelliklerinin değerlendirilmesi ve ABTS, katekol, dopamin ile epikateşin substratları üzerinden kontrol düzeltilmiş absorbans/renk yanıtı oluşturma potansiyelinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, substrata bağlı renk değişimi çıktılarının gelecekte geliştirilebilecek lakkaz te-melli kolorimetrik deteksiyon sistemleri için yöntem tasarımına ve validasyon basamakları-na yön gösterecek temel karakterizasyon verileri sağlaması hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Çalışmada öncelikle B. coagulans DSM1, B. cereus ATCC 11778, B. sphaericus DSM 396, B. subtilis ATCC 6633 ve B. clausii suşlarında katı besiyerinde lakkaz-benzeri renklenme taraması yapılmıştır. Genomik DNA'dan hedef CotA bölgesinin doğrudan PCR ile çoğaltılmasında özgül bant elde edilemediğinden, GenBank GU972592.1 ile uyumlu CotA referans dizisine dayalı sentetik gen stratejisi uygulanmıştır. Kodon optimize CotA in-serti pET30a(+) vektörüne aktarılmış, E. coli BL21(DE3)'te laktoz ile indüklenmiş ve re-kombinant protein HPLC-IMAC/Ni-NTA temelli yöntemle saflaştırılmıştır. Fraksiyonlar SDS-PAGE ile değerlendirilmiş; ticari lakkaz karşılaştırması, pH profili, sıcaklık stabilitesi, ısıl inaktivasyon, enzim/substrat konsantrasyonu etkisi ve Km ve Vmax kinetik parametreleri Lineweaver-Burk analiziyle incelenmiştir. Renk oluşturma analizlerinde her substrat için or-taya çıkan renk/absorbans yanıtları kontrol kuyucuklarıyla birlikte değerlendirilmiş; böylece substrata özgü kolorimetrik sinyal profili karşılaştırmalı olarak izlenmiştir. Bulgular: Bacillus türlerinde substrata bağlı renk değişimleri gözlenmiş ve bu bulgular lakkaz-benzeri oksidatif renklenme olarak değerlendirilmiştir. Rekombinant plazmidin doğrulanması, yaklaşık 1,5 kb büyüklüğündeki CotA insertine ve pET30a(+) vektörüne ait beklenen bantların agaroz jel elektroforezinde gözlenmesiyle desteklenmiştir. SDS-PAGE'de yaklaşık 55–60 kDa aralığında CotA ile uyumlu baskın bant izlenmiş, bu sonuç hedef protein açısından zenginleşmiş fraksiyonların elde edildiğini göstermiştir. Rekombinant CotA, tüm substratlarda ölçülebilir kontrol düzeltilmiş renk yanıtı oluşturmuş; en belirgin yanıt ABTS ile gözlenmiştir. Sonuç: Bu çalışma, CotA lakkazının rekombinant olarak üretilebildiğini, HPLC-IMAC/Ni-NTA ile hedef protein bakımından zenginleştirilebildiğini ve farklı substratlara karşı ayırt edilebilir kolorimetrik yanıtlar oluşturabildiğini göstermektedir. Bulgular, ileri kolorimetrik sistem geliştirme ve validasyon çalışmaları için karşılaştırmalı karakterizasyon verisi olarak değerlendirilmelidir.
Özet (Çeviri)
Objective: This study aimed to recombinantly produce the Bacillus subtilis-derived CotA laccase enzyme in the Escherichia coli BL21(DE3) expression system, to enrich the target protein using an HPLC-IMAC/Ni-NTA-based approach, to evaluate its main biochemical properties, and to investigate its potential to generate control-corrected absorbance/color responses with ABTS, catechol, dopamine, and epicatechin substrates. Within this scope, substrate-dependent color-change outputs were also intended to provide foundational charac-terization data that may guide the design and validation stages of future laccase-based colo-rimetric detection systems. Materials and Methods: In the first stage of the study, laccase-like color formation was screened on solid medium in B. coagulans DSM1, B. cereus ATCC 11778, B. sphaericus DSM 396, B. subtilis ATCC 6633, and B. clausii strains. Since direct PCR amplification of the target CotA region from genomic DNA did not yield a specific band, a synthetic gene strategy based on the CotA reference sequence compatible with GenBank GU972592.1 was applied. The codon-optimized CotA insert was transferred into the pET30a(+) vector, indu-ced with lactose in E. coli BL21(DE3), and target-protein-enriched recombinant fractions were obtained using an HPLC-IMAC/Ni-NTA-based method. The fractions were evaluated by SDS-PAGE; commercial laccase comparison, pH profile, temperature stability, thermal inactivation, enzyme/substrate concentration effects, and Km and Vmax kinetic parameters were examined by Lineweaver-Burk analysis. In color formation analyses, substrate-specific absorbance/color responses were evaluated together with control wells, allowing comparati-ve monitoring of the colorimetric signal profile. Results: Substrate-dependent color changes were observed in Bacillus species, and these findings were evaluated as laccase-like oxidative color formation. Verification of the recombinant plasmid was supported by the observation of the expected bands corresponding to the approximately 1.5 kb CotA insert and the pET30a(+) vector in agarose gel electrophoresis. A dominant band compatible with CotA was observed at approximately 55–60 kDa in SDS-PAGE, indicating that fractions enriched in the target protein were obtained. Recombinant CotA produced measurable control-corrected color responses with all substrates, with the most pronounced response observed for ABTS. Conclusion: This study demonstrates that CotA laccase can be recombinantly produced, en-riched in target protein using HPLC-IMAC/Ni-NTA, and can generate distinguishable colo-rimetric responses toward different substrates. These findings should be evaluated as compa-rative characterization data for future colorimetric system development and analytical vali-dation studies.
Benzer Tezler
- Pycnoporus sanguineus kaynaklı rekombinant lakkaz PSLCC2 kullanımı ile tekstil boyalarında renk giderimi
Decolorization of textile dyes using recombinant laccase PSLCC2 from Pycnoporus sanguineus
KORAY MALCI
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi
ORKUN PİNAR
Doktora
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Recombinant production of pectinolytic enzymes in pichia pastoris and process optimization for food industry
Gıda endüstrisinde kullanılan pektinaz enziminin pichia pastoris'te rekombinant üretimi ve süreç optimizasyonu
GÜLŞAH AKÇADAĞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyomühendislikYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ İLKEM EMRAH NİKEREL
- Bacillus subtilisten lakkaz enzim izolasyonu, üretici genin klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve boya gideriminde etkinliğinin araştırılması
Izolation, cloning, characterization, and investigation of dye decolorization activity of laccase enzyme from Bacillus subtilis
ORKIDEH HAJIPOUR
Doktora
Türkçe
2020
BiyoteknolojiPamukkale ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN
PROF. DR. SADIK DİNÇER
- Cloning and heterologous expression of a laccase isozyme gene from Coriolopsis polyzona MUCL 38443
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi
ÖZNUR PEHLİVAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Mikrobiyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ