EAG1 iyon kanalının in vitro hedeflenmesi için kolorektal kanser hücre hattında nanobody tasarımı
Nanobody design in colorectal cancer cell line for in vitro targeting the EAG1 ion channel
- Tez No: 1023573
- Danışmanlar: PROF. DR. AHMET ÇARHAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Kanser Biyolojisi Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Kolorektal kanser, dünya genelinde en sık görülen malignitelerden biri olup kansere bağlı ölümlerin başlıca nedenleri arasındadır. Hastalığın erken ve hedefe özgü saptanabilmesi için klasik tanı yöntemlerini destekleyecek yeni moleküler araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. Normal erişkin dokularda sınırlı, birçok tümör tipinde ise artmış ekspresyon gösteren EAG1/Kv10.1 potasyum iyon kanalı, kolorektal kanser için dikkat çekici bir membran hedefidir. Bu tez çalışmasında, EAG1 iyon kanalını özgül olarak tanıyabilecek nanobody adaylarının tasarlanması, seçilmesi, rekombinant olarak üretilmesi ve kolorektal kanser hücrelerinde in vitro hedefleme potansiyelinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle EAG1 proteininin hücre dışı erişilebilir bölgeleri biyoinformatik olarak analiz edilmiş ve hedeflemeye uygun ekstraselüler bölge belirlenmiştir. Farklı CDR3 uzunluklarına sahip sentetik nanobody kütüphaneleri oluşturulmuş; ribozom gösterimi temelli seçim ve biyopanning ile biyotinlenmiş EAG1 hedef peptidine bağlanma potansiyeli taşıyan havuzlar zenginleştirilmiştir. RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve PZR amplifikasyonu sonrasında LIB1, LIB2 ve LIB3 kütüphanelerinden aday diziler geri kazanılmıştır. Seçilen nanobody adayları pET-28a(+) vektörüne klonlanmış, sekanslama ile doğrulanmış ve moleküler docking analizleriyle EAG1 hedef bölgesiyle olası etkileşimleri değerlendirilmiştir. Seçilen varyant, Escherichia coli BL21(DE3) sisteminde rekombinant olarak üretilmiş ve Ni-NTA afinite kromatografisiyle saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ve Anti-His Western blot analizleri üretim ve saflaştırmanın başarılı olduğunu göstermiştir. Saflaştırılan protein FITC ile konjuge edilmiş; floresan görüntüleme ve akış sitometrisi analizleri işaretlemenin başarılı olduğunu doğrulamıştır. FITC-konjuge nanobody, HT-29 kolorektal kanser hücreleri ile sağlıklı kolon fibroblast hücre hattı CCD-18Co üzerinde değerlendirilmiş ve HT-29 hücrelerinde daha yüksek floresan sinyal gözlenmiştir. Bu farklılık, nanobody'nin hedef hücrelerde EAG1 ekspresyonuyla ilişkili seçici bağlanma gösterebildiğini ve sağlıklı kolon hücrelerinden ayrım sağlayabileceğini düşündürmüştür. Böylece geliştirilen yapı tanısal görüntüleme açısından işlevsel bir moleküler adaydır. Sonuç olarak bu çalışma, EAG1'e özgü nanobody adaylarının sentetik kütüphane-ribozom gösterimi yaklaşımıyla seçilebildiğini, rekombinant üretilebildiğini ve floresan işaretleme sonrasında hücre temelli hedefleme çalışmalarında kullanılabildiğini ortaya koymuştur. Bulgular, geliştirilen FITC-konjuge nanobody'nin kolorektal kanserde hedefe yönelik in vitro görüntüleme ve gelecekteki tanısal uygulamalar için umut verici bir moleküler prob olduğunu desteklemektedir.
Özet (Çeviri)
Colorectal cancer is among the most common malignancies and remains a leading cause of cancer-related mortality. New molecular tools are needed to support conventional diagnostic approaches and enable early, target-specific detection. The EAG1/Kv10.1 potassium ion channel, which shows limited expression in normal adult tissues but increased expression in several tumor types, has emerged as a membrane target in colorectal cancer. This thesis aimed to design, select, recombinantly produce, and evaluate nanobody candidates capable of recognizing EAG1 in colorectal cancer cells in vitro. First, extracellularly accessible regions of the EAG1 protein were analyzed, and an extracellular target region was identified. Synthetic nanobody libraries with different CDR3 lengths were then generated, and ribosome display-based selection and biopanning were used to enrich nanobody pools with binding potential toward the biotinylated EAG1 target peptide. Following RNA isolation, cDNA synthesis, and PCR amplification, candidate sequences were recovered from the LIB1, LIB2, and LIB3 libraries. Selected nanobody candidates were cloned into the pET-28a(+) expression vector, verified by sequencing, and assessed by molecular docking for their potential interactions with the EAG1 target region. The selected variant was recombinantly expressed in Escherichia coli BL21(DE3) and purified by Ni-NTA affinity chromatography. SDS-PAGE and Anti-His Western blot analyses confirmed production and purification. The purified protein was conjugated with FITC, and fluorescence imaging and flow cytometry verified labeling. The FITC-conjugated nanobody was evaluated in HT-29 colorectal cancer cells and healthy CCD-18Co colon fibroblasts. Higher fluorescence signals were observed in HT-29 cells, suggesting EAG1-related selective binding and discrimination from healthy colon cells. Overall, this study demonstrates that EAG1-specific nanobodies can be selected using a synthetic library-ribosome display strategy, recombinantly produced, fluorescently labeled, and applied in cell-based targeting analyses. The findings support the developed FITC-conjugated nanobody as a promising molecular probe for targeted in vitro imaging and future diagnostic applications in colorectal cancer.
Benzer Tezler
- İmipramin'in MCF-7 hücre hattında eag1 potasyum kanalları üzerine sitotoksik ve elektrofizyolojik etkileri
Cytotoxic and electrophysiological effects of imipramine on eag1 potassium channels in the MCF-7 cell line
BARIŞ UÇAR
- Astemizol ve imipramin'in DU-145 prostat hücre hatlarına sitotoksik ve Eag1 kanalları üzerine elektrofizyolojik etkileri
The astemizole and imipramine effects on cytotoxicity of DU-145 cell line and on electrophysiology of Eag1 channels
ONUR ÖZTANRIVERDİ
- İmipramine'in prostat kanserinde potasyum kanal kinetikleri üzerine etkilerinin araştırılması
Investigetion of the effect of imipramine on potassium channel kinetics in prostate cancer
FATMA SÖĞÜT
- Escherichia coli'de aşırı ifade edilen genlerin bor toleransına etkisinin araştırılması ve bora bağlı gen ekspresyon analizleri
Investigating the effects of over expressed genes on boron tolerance in Escherichia coli and gene expression analyzes pertaining to boron
ESRA DİBEK
Doktora
Türkçe
2020
MikrobiyolojiMuğla Sıtkı Koçman ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
- Gökkuşağı alabalık solungacından 6- fosfoglukonat dehidrogenaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigatiuons on purification and characterization of 6 - phosphogluconate dehydrogenase from rainbow trout gills and inhibition effects of some metal ions on the enzyme activity
ARZU ÖZTÜRK KESEBİR