Doğal renkli pamukta genom düzenleme için crıspr/cas sisteminin uygulanması
The application of crispr/cas system for genome editing in naturally colored cotton
- Tez No: 1023860
- Danışmanlar: PROF. DR. NESLİHAN TURGUT KARA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biyoloji, Genetik, Biotechnology, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Kullanım alanının giderek genişlemesi nedeniyle pamuk bitkisi, başta tekstil sektörü olmak üzere çeşitli endüstriler için stratejik öneme sahip bir hammadde niteliği taşımaktadır. Tekstil endüstrisinde hammadde olarak çok çeşitli lif türlerinden yararlanılmakta olup bu liflerin seçiminde işlenebilirlik, nem absorpsiyon kapasitesi, üretim verimliliği ve maliyet etkinliği gibi parametreler belirleyici rol oynamaktadır. Doğal renkli pamuklar, geleneksel pamuğun aksine kimyasal boyar madde gerektirmediklerinden işlenme maliyetlerini düşürmeleri ve çevre dostu yapıları nedeniyle giderek daha fazla ilgi çekmektedir. Bununla birlikte, doğal renkli pamuk liflerinin kısa, zayıf ve düşük verimli olması, bu liflerin tekstil makineleriyle işlenmesini güçleştirmektedir. Doğal renkli pamukların tekstil endüstrisinde daha yaygın biçimde kullanılabilmesi için çeşitli agronomik özelliklerin iyileştirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla çalışmanın başlangıcında, CAPRICE (GhCPC) geninin transgenik olmayan bir yaklaşımla susturulması için Cas9-sgRNA-RNP kompleksinin PEG aracılı yöntemle kotiledonlardan elde edilen protoplastlara aktarılması planlanmıştır. Genom düzenlemesi öncesinde protoplast izolasyonu ile mikrokallus aşamasından tam bitki elde edilmesine yönelik protokol optimizasyonu çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ancak elde edilen protoplastlardan mikrokallus eldesi sağlanamamış; bu nedenle çalışma materyali olarak yeniden boyutlandırılmış olgun öncesi embriyolar kullanılmıştır. Bu değişiklikle birlikte CRISPR bileşenlerinin embriyolara aktarılmasında elektroporasyon yöntemine karar verilmiş ve yöntemin optimizasyonu GFP-Cas9 kompleksinin aktarımıyla gerçekleştirilmiştir. Sarıgelin genotipinde genom düzenlemesi, GhCPC geni için tasarlanan sgRNA'ların Cas9 proteini ile birlikte elektroporasyon yoluyla embriyolara aktarılmasıyla yürütülmüştür. İşlem sonrasında in vitro koşullarda kök ve sürgün gelişimi gösteren bitkicikler in vivo ortama aktarılmış, ilk yaprak aşamasında dizi analizi için örnekler toplanmıştır. Nükleik asit izolasyonunun ardından sgRNA hedef bölgelerini kapsayan primerlerle PZR gerçekleştirilmiş, ürünler pCE3 Blunt vektörüne klonlanmış ve düzenlemenin doğrulanması amacıyla Sanger dizileme uygulanmıştır. Altı örneğe ait dizi analizi sonucunda hedefli düzenlemenin gerçekleşmediği belirlenmiştir. İstenen CRISPR aracılı hedefli düzenlemenin sağlanamamasının olası nedenleri arasında materyal olarak embriyo kullanımına bağlı rejenerasyon sonrası kimerizm oluşumu, pamuğun rekalsitrant genotip yapısı ve Cas9'un hedef dışı bölgelere bağlanması sayılabilir. Bu sorunların aşılması amacıyla ilerleyen çalışmalarda, pamuk endojen promotörü (GhU6) içeren bir vektör aracılığıyla Cas9 ve sgRNA ekspresyonunun artırılması ve böylece düzenleme veriminin yükseltilmesi öngörülmektedir.
Özet (Çeviri)
Due to its expanding range of applications, the cotton plant serves as a strategically important raw material for various industries, particularly the textile sector. In the textile industry, a wide variety of fiber types are utilized as raw materials, with parameters such as processability, moisture absorption capacity, production efficiency, and cost-effectiveness playing a decisive role in fiber selection. Naturally colored cottons are attracting increasing attention due to their ability to reduce processing costs and their environmentally friendly nature, as they do not require chemical dyes unlike conventional cotton. However, the short, weak, and low-yield fibers of naturally colored cotton make processing by textile machinery challenging. To enable more widespread use of naturally colored cottons in the textile industry, various agronomic traits require improvement. To this end, at the outset of the study, delivery of the Cas9-sgRNA-RNP complex into cotyledon-derived protoplasts via PEG-mediated transformation was planned for the non-transgenic silencing of the CAPRICE (GhCPC) gene. Prior to genome editing, optimization studies were conducted for protoplast isolation and the protocol for obtaining whole plants from the microcallus stage. However, microcallus formation from the isolated protoplasts could not be achieved; therefore, pre-mature embryos were used as the working material. With this change, electroporation was adopted for the delivery of CRISPR components into embryos, and method optimization was carried out using GFP-Cas9 complex delivery. Genome editing in the Sarıgelin genotype was performed by delivering sgRNAs designed for the GhCPC gene together with Cas9 protein into embryos via electroporation. Following the procedure, plantlets exhibiting root and shoot development under in vitro conditions were transferred to an in vivo environment, and samples were collected at the first leaf stage for sequence analysis. After nucleic acid isolation, PCR was performed using primers spanning the sgRNA target regions; the products were cloned into the pCE3 Blunt vector, and Sanger sequencing was applied to confirm the editing. Sequence analysis of six samples revealed that targeted editing had not occurred. Among the possible reasons for the failure to achieve the desired CRISPR-mediated targeted editing are post-regeneration chimerism arising from the use of embryos as material, the recalcitrant genotype of cotton, and non-specific binding of Cas9 to off-target sites. To overcome these challenges, future studies are expected to focus on enhancing Cas9 and sgRNA expression through a vector carrying the cotton endogenous promoter (GhU6), thereby increasing editing efficiency.
Benzer Tezler
- Doğal yeşil renkli pamukta (Gossypium hirsutum L.) lif renk genlerini kontrol eden dna markırlarının belirlenmesi ve quantitative trait locus (QTL) analizi
Identification of DNA markers controlling fiber color genes in natural green colored cotton (Gossypium hirsutum L.) and quantitative trait locus (QTL) analysis
DEVRİM SEMİZER CUMİNG
- Doğal renkli pamuk (Gossypium hirsutum L.) üzerinde biyoteknolojik çalışmalar
Biotechnological studies on naturally colored cotton (Gossypium hirsutum L.)
ONUR AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NESLİHAN TURGUT KARA
- Harran ovası koşullarında renkli ve beyaz pamukta (G. hirsutum L.) farklı organik ve mineral gübre kullanımının; bitkisel özellikler ve lif kalite özelliklerine etkisi konusunda bir araştırma
A study on the effect of the use of different organic and mineral fertilizers on colored and white cotton (G. hirsutum L.) on herbal characteristics and fiber quality in the harran plain conditions
HARUN DEMOOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
GenetikHarran ÜniversitesiTarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CEVHER İLHAN CEVHERİ
- Üç farklı lif rengine (yeşil, kahverengi ve beyaz) sahip pamuk genotiplerinin (Gossypium hirsutum L. ) yaprak, lif, tohum kabuğu ile tohum iç kısmının, ağır metal - mikro besin elementi konsantrasyonlarının saptanması
Cotton genotypes (Gossypium hirsutum L. ) which have three different fiber colour determine heavy metal - micronutrient concentrations of cotton leaf, fiber, seed coat and seed inside
KENAN BOYACI
Yüksek Lisans
Türkçe
2003
ZiraatÇukurova ÜniversitesiTarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SEZER SİNAN