Crıspr-cas9 yöntemi ile marulda hap2 geninin knock-out edilmesiyle erkek kısırlığı oluşturmak
Inducing male sterility by knock-out of the hap2 gene in lettuce using the crispr-cas9 method
- Tez No: 1024491
- Danışmanlar: PROF. DR. NEDİM MUTLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Ziraat, Biyoloji, Biotechnology, Agriculture, Biology
- Anahtar Kelimeler: CRISPR, CRISPR
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Marul, ticari değeri yüksek ve yaygın olarak yetiştirilen önemli bir sebze türüdür. Ancak çoğunlukla kendine döllenen bir bitki olması ve küçük çiçek yapısı, kontrollü melezleme çalışmalarını ve F1 hibrit tohum üretimini güçleştirmektedir. Erkek kısırlık sistemleri, hibrit tohum üretiminde dişi ebeveynin kendi poleniyle döllenmesini engelleyerek melezleme etkinliğini artıran önemli araçlardır. Bu tez çalışmasında, erkek gamet füzyonunda görev alan korunmuş bir gen olan HAP2'nin CRISPR/Cas9 yöntemiyle hedeflenerek marulda erkek kısırlık oluşturulması amaçlanmıştır. Çalışmada öncelikle Lactuca sativa HAP2 genine ait biyoinformatik analizler yapılmış, hedef bölgeler belirlenmiş ve 5 farklı gRNA tasarlanmıştır. HAP2 genini hedeflemek amacıyla pDIRECT_23C ve pFGC-pcoCas9 tabanlı CRISPR/Cas9 ikili vektörleri oluşturulmuş, klonlama işlemleri PCR ve Sanger dizileme analizleriyle doğrulanmıştır. Daha sonra Caipira, Emocion, Festival, Funtime, Garone, Maritima, Rüzgar, Sürpriz ve Vaidosa olmak üzere dokuz farklı marul çeşidinde doku kültürü ve Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon çalışmaları yürütülmüştür. Transformasyon denemelerinde EHA105 ve LBA4404 suşlarının etkinliği karşılaştırılmıştır. Elde edilen bulgular, marulda transformasyon başarısının genotipe ve kullanılan Agrobacterium suşuna bağlı olarak değiştiğini göstermiştir. PCR analizleriyle transgenik olduğu doğrulanan toplam 34 T0 bitkisi taranmış ve HAP2 hedef bölgeleri Sanger dizileme yöntemiyle incelenmiştir. T1 generasyonunda ise toplam 42 transgenik bitki taranarak dizilenmiş; ancak gerek T0 gerekse T1 bitkilerinin hedef bölgelerinde herhangi bir indel veya nokta mutasyonu tespit edilmemiştir.RT-qPCR analizleri, transgenik bitkilerde Cas9 ve gRNA transkriptlerinin ifade edildiğini göstermiştir. Sonuç olarak, bu tez kapsamında hedeflenen HAP2 knock-out mutantı ve buna bağlı erkek kısır marul bitkisi elde edilememiştir. Bununla birlikte çalışma, marulda CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenleme uygulamaları için önemli bir deneysel altyapı sunmuştur. Dokuz marul çeşidinin rejenerasyon ve transformasyon yanıtlarının karşılaştırılması, EHA105 suşunun daha etkili olduğunun belirlenmesi, Emocion çeşidinin transformasyona daha yüksek yanıt vermesi ve transgenik bitkilerde Cas9/gRNA ekspresyonunun gösterilmesi çalışmanın başlıca çıktılarıdır. Bu yönüyle tez, marulda HAP2 geninin hedeflenmesine yönelik ilk adımları ortaya koymakta ve gelecekte yapılacak gen düzenleme, erkek kısırlık ve hibrit ıslah çalışmalarına deneysel bir temel oluşturmaktadır.
Özet (Çeviri)
Lettuce is an important vegetable species with high commercial value and widespread cultivation. However, its predominantly self-pollinating nature and small flower structure make controlled hybridization difficult and F1 hybrid seed production economically not feasible. Male sterility systems are important tools in hybrid seed production, as they prevent self-pollination of the female parent and thereby increase the efficiency of hybridization and reduces the cost of hybrid seed. In this thesis, it was aimed to induce genetic male sterility in lettuce by targeting HAP2, a conserved gene involved in male gamete fusion, using the CRISPR/Cas9 system. In the study, bioinformatic analyses of the Lactuca sativa HAP2 gene were first performed, target regions were identified, and 5 different gRNAs were designed. To target the HAP2 gene, CRISPR/Cas9 binary vectors based on pDIRECT_23C and pFGC-pcoCas9 were constructed, and the cloning procedures were confirmed by PCR and Sanger sequencing analyses. Subsequently, tissue culture and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation studies were carried out in nine lettuce cultivars, namely Caipira, Emocion, Festival, Funtime, Garone, Maritima, Rüzgar, Sürpriz, and Vaidosa. In the transformation experiments, the efficiencies of the EHA105 and LBA4404 strains were compared. The results showed that transformation success in lettuce varied depending on the genotype and the Agrobacterium strain used. A total of 34 transgenic T0 plants confirmed by PCR analysis were screened, and the HAP2 target regions were examined by Sanger sequencing. In the T1 generation, 42 transgenic plants were similarly screened and sequenced; however, no indel or point mutations were detected in the target regions of either the T0 or selected T1 plants. RT-qPCR analyses demonstrated that Cas9 and gRNA transcripts were expressed in the transgenic plants. As a result, the targeted HAP2 knock-out mutant and the associated male-sterile lettuce plant could not be obtained within the scope of this thesis. Nevertheless, this study provides an important experimental basis for CRISPR/Cas9-based genome editing applications in lettuce. The comparison of regeneration and transformation responses among nine lettuce cultivars, the determination that the EHA105 strain was more effective, the higher transformation response of the Emocion cultivar, and the demonstration of Cas9/gRNA expression in transgenic plants are the main outcomes of the study. A very efficient lettuce transformation has been established in the lab. In this respect, the thesis represents an initial step toward targeting the HAP2 gene in lettuce and provides an experimental foundation for future studies on genome editing, male sterility, and hybrid breeding.
Benzer Tezler
- CRISPR/Cas9 yöntemi ile hıyar mozaik virüs (CMV)'üne dayanıklı transgenik olmayan kavun genotipinin geliştirilmesi
Development of non-transgenic melon genotype resistant to cucumber mosaic virus (CMV) by CRISPR/Cas9 method
SERDAR ALTINTAŞ
- CRISPR\Cas9 yöntemi aracılığı ile insan CCDC 124 geni delesyonunun hücre bölünmesi üzerine etkileri
Effects of CRISPR\Cas9 mediated human CCDC124 gene deletion on cellular division
SİNEM GÜL
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
GenetikGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY
- Pankreas hücre hattında CRISPR/Cas9 Yöntemi ile collagen triple helix repeat containing 1 (CTHRC1) geninin susturulmasının matriks metalloproteinaz (MMP) protein ifadesi ve tümörün metastatik kapasitesi üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of silencing collagen triple helix repeat containing 1 (CTHRC1) gene by CRISPR/Cas9 Method on matrix metalloproteinase (MMP) protein expression and metastatic capacity of tumor in pancreatic cell line
GÜLHAN DEMİR
Doktora
Türkçe
2022
GenetikKocaeli ÜniversitesiTıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ SEDA EREN KESKİN
- Kanserli hücre hattında crıspr/cas9 yöntemi ile gen susturma
Gene silencing with crispr/cas9 method in cancer cell line
SELDA KONDAKÇI
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyolojiKırıkkale ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA AZİZE BUDAK YILDIRAN
- Meme kanserinde CRISPR/cas9 yöntemi ile WWOX ve WBP2 genlerinin düzenlenmesinin tamoksifen direnci üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of editing WWOX and WBP2 genes by CRISPR/cas9 method on tamoxifen resistance in breast cancer
EBRUCAN BULUT
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Tıbbi BiyolojiBursa Uludağ ÜniversitesiTemel Tıp Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLŞAH ÇEÇENER