Mycobacterium tuberculosis suşlarında rpsL 43. kodon mutasyonu ile oluşan streptomisin direncinin polimeraz zincirleme reaksiyonu ve floresans rezonans enerji transferi kullanılarak hızlı şekilde saptanması
Rapid detection of streptomycin resistance associated with rpsL codon 43 mutation in mycobacterium tuberculosis strains by using polymerase chain reaction and fluorescence resonance energy transfer
- Tez No: 111444
- Danışmanlar: PROF.DR. SEYYAL ROTA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2001
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gazi Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 1282
Özet
VIII ÖZET İlaca dirençli M. tuberculosis suşlarının yayılmasının en aza indirilebilmesi için hızlı tanı yöntemleri gerekmektedir. Dirençli suşların hızlı saptanmasında yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri ile moleküler yöntemler önemli bir potansiyele sahiptir. Bu yöntemler etkenin in vitro üretilmesini gerektirmediğinden tanı ve etkin tedavinin başlatılması arasındaki süreyi kısaltmaktadır. S 12 proteinini kodlayan rpsL geni ile 16SrRNA' yi kodlayan rrs genindeki nokta mutasyonlar ile streptomisin direnci oluşmaktadır. Streptomisin direncine neden olan nokta mutasyonların çoğu rpsL geninde ortaya çıkmaktadır. En sık saptanan mutasyon 43. kodonda AAG- »AGG değişikliği ile lizin amino asidinin arginin amino asidine değişimiyle sonuçlanan mutasyondur. Bu çalışmada M.tuberculosis suşlarındaki rpsL geni 43. kodon mutasyonları Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu (PZR) ve Floresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanılarak araştırılmıştır. Uygulaması kolay olan bu yeni metod ile PZR sonrası işlemlere gerek kalmamaktadır ve hızlı döngülü amplifikasyon ile florometrik analiz iç içedir. Middlebrook 7H10 besiyeri kullanılarak yapılan direnç-oran yöntemi ile dirençli olduğu belirlenmiş 25 streptomisine dirençli M.tuberculosis suşunda floresans rezonans enerji transferi probları ile iki farklı erime sıcaklığı eğrisi elde edildi. Yirmi beş dirençli susun 16' sında ve 47 streptomisine duyarlı suşda, kontrol suş M.tuberculosis H37Ra ile benzer erime sıcaklığı eğrisi elde edilirken, 9 streptomisine dirençli M.tuberculosis suşunda oldukça farklı erime sıcaklığı eğrisi elde edildi. Böylece 9 suştaki streptomisin direnci PZR-FRET yöntemi ile saptanabildi.IX PZR-FRET yöntemi sonuçlarını doğrulamak amacı ile kontrol suş ve rastgele seçilmiş 6 örneğe ait rpsL genlerinin DNA dizi analizi yapıldı. Streptomisine dirençli her iki gruptan üçer suş ile çalışıldı. DNA dizi analizi ile rpsL genindeki 43. kodon mutasyonları araştırıldı. Toplam 7 örnek için önceki değerler ile uyumlu sonuçlar elde edildi. PZR-FRET ile streptomisine dirençli olarak değerlendirilmiş üç susun üçünde de 43. kodon mutasyonu saptandı. Mutasyonların hepsi 43. kodonda AAG lizin kodonunun AGG arginin kodonuna değişimi şeklinde gelişen mutasyonlar olarak tesbit edildi. M. tuberculosis H37Ra ile benzer erime sıcaklığı eğrisi göstermiş örneklerin hiçbirisinde 43. kodon mutasyonu saptanmadı. Bu pilot çalışma; kolay uygulanan ve iki saatten az zaman alan PZR-FRET yönteminin, rpsL geni 43. kodon mutasyonu ile oluşan streptomisin direncinin hızlı saptanmasında kullanışlı bir yöntem olabileceğini göstermiştir.
Özet (Çeviri)
XI SUMMARY Rapid identification procedures are needed to minimize the transmission of drug-resistant M. tuberculosis strains. Molecular methods have the potential to provide rapid detection of drug-resistant strains due to their high sensitivity and specificity. Since these procedures do not rely on in vitro growth, the time between diagnosis and the onset of effective therapy is shortened. Resistance to streptomycin is due to point mutations in either the ribosomal S12 protein gene (rpsL) or the 16S rRNA gene (rrs). The majority of point mutations producing STR resistance occur in rpsL gene. The most common mutation is an AAG-»AGG change in codon 43 resulting in a Lys-»Arg substitution. In this study, mutations in rpsL gene codon 43 in M. tuberculosis strains were investigated by PCR and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) method. This new method which is very easy to perform, doesn't require any post-PCR sample manipulation and also fluorimetric detection and rapid cycler amplification are incorporated. Twenty five M. tuberculosis strains which were already determined to be streptomycin- resistant by resistance-ratio method using Middlebrook 7H10 medium, showed two different melting curve patterns by FRET probes. While sixteen of 25 resistant strains and 47 streptomycin-sensitive strains had similar melting curve patterns to control strain M. tuberculosis H37Ra, nine of them had quite different melting curve patterns. Thus it was possible to determine streptomycin resistance in these nine strains by PCR-FRET method. DNA sequencing of the rpsL genes of randomly selected six strains and the control strain were performed to confirm the results of PCR- FRET method. Three strains belonged to each streptomycin-resistant groupXII were investigated. DNA sequencing of the rpsL gene was performed to detect the mutations at codon 43. Concordant results were obtained in all of those seven strains. Mutation was observed at codon 43 in all of the strains which were determined to be streptomycin-resistant M. tuberculosis strains by PCR-FRET method. All of the mutations at amino acid 43 were due to a transition changing of the AAG Lys codon to an AGG Arg codon. Strains which had similar melting peaks like to M. tuberculosis H37Ra had no mutation at codon 43. This pilot study showed that PCR-FRET method which takes less then two hours and easy to perform, could be useful in rapid determination of streptomycin resistance due to mutations in rpsL gene at codon 43.
Benzer Tezler
- Mycobacterium tuberculosis suşlarında direncin moleküler yöntemlerle tespiti
Detection of the resistance in Mycobacterium tuberculosis with PCR
MEDİHA BEGÜM KAYAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
MikrobiyolojiÇukurova ÜniversitesiMikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. FATİH KÖKSAL
- Mycobacterıum tuberculosıs suşlarında primer antitüberküloz ilaç direncinin BACTEC MGIT 960 sistemi ile araştırılması
Invastigation of primary antitüberculosis drug resistance using BACTEC MGIT 960 system in mycobacterium tuberculosis strains
MEVLİYE ZEKİ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2011
MikrobiyolojiHarran ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FADİLE YILDIZ ZEYREK
- Mycobacterium tuberculosis suşlarında eflüks pompasını oluşturan gen ekspresyonlarının çoklu ilaç direnç gelişimi üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the relation of multiple drug resistance with the expression of genes which made of efflux pump in mycobacterium tuberculosis
MUSTAFA KEREM ÇALGIN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2012
MikrobiyolojiAnkara ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET KIYAN
- Mycobacterium tuberculosis suşlarında rifampisin direncinin polymerase chain reaction-heteroduplex analizi ile belirlenmesi
Detection of rifampicin resistance in mycobacterium tuberculosis strains by polymerase chain reaction-heteroduplex analysis
HÜLYA ŞİMŞEK
- Mycobacterium tuberculosis suşlarında rifampisin direnci saptamada mikobakteriofaj(Fastplaque TB-RİF) yönteminin erken tanı değeri, LöwensteinJensen ve BACTEC yöntemleri ile karşılaştırılması
Early diagnosis value of mycobacteriophage (Fastplaque TB-RIF) method in detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis strains, comparison with Löwenstein Jensen and BACTEC methods
NALAN ADIGÜZEL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2002
Göğüs HastalıklarıSağlık BakanlığıGöğüs Hastalıkları Ana Bilim Dalı
UZMAN MELAHAT KURUTEPE