Geri Dön

DHPLC metodu ile P53 geninin 248. ve 249. amino asitlerini kodlayan kodonlarda oluşan mutasyonların tespiti

Detection of mutations coding amino acids 248 and 249 of P53 gene using DPHLC method

  1. Tez No: 132319
  2. Yazar: ŞÜKRÜ ERHAN ERGEN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. BEYAZIT ÇIRAKOĞLU
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2003
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Marmara Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 72

Özet

l.ÖZET Bir iyon çifti ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi metodu olan denatüran yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (DHPLC), polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış çift zincirli DNA dizilimlerindeki farklı bazlar yüzünden oluşan bağlanmamış bölgelerin meydana getirdiği heterodupleks yapıları temel alarak mutasyon ve polimorflzm taranmasında kullanılır. Yöntem ucuz, etkin, tekrarlanabilir ve kolay olması açısından son zamanlarda polimorflzm ve nokta mutasyonu tespiti için rutin bir laboratuvar uygulaması haline gelmeye başlamıştır. Çalışmada TÜBÎTAK Marmara Araştırma Merkezi, Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Arastama Enstitüsü'nde mevcut bulunan HPLC sistemi DHPLC analizine uygun hale getirilmiştir. Sistemin etkinliği ve güvenirliği, 248 'inci ve 249 'uncu amino asitlerini kodlayan kodonlarında bilinen nokta mutasyonları bulunan P53 geninin 300 nükleotidlik bölgesi kullanılarak yapılan deneylerle kanıtlanmıştır. pBluescript II SK(+) plazmidinin BamHI ve Spel restriksiyon enzim kesim bölgeleri arasına klonlanmış olan, doğal ve 248'inci ve 249'uncu amino asitleri kodlayan kodonlannda nokta mutasyonu bulunan 300 nükleotid uzunluğundaki PS3 gen formları özgül primerler kullanılarak çoğaltıldıktan sonra kaynatılarak denature edilmiş ve doğal ve mutant formlar karıştırılarak homo ve heterodupleks yapıların eldesi sağlanmıştır.“The DHPLC Melt Program”tarafından belirlenen 58°C'lik kısmi denatüran kolon sıcaklığında ve HaelII restriksiyon enzimi ile kesilmiş pBR322 plazmidi kullanılarak yapılan kolon kalibrasyonu ile belirlenen dakikada 0.6 mi akış hızında yapılan DHPLC analizleri sonrasında elde edilen kromatogramlarda, sadece homoduplekslerin verdiği tek, yarılmamış ve ideal bir gausian pikinin yanı sıra gözlemlenen daha erken elüe olmuş ve yarılmış pik oluşumlarına dayanarak örneklerde heterodupleks yapıların tespiti yapılmıştır. Mevcut HPLC sistemlerinin yapılan küçük eklemelerle DHPLC analizi ile polimorflzm ve nokta mutasyonlarının taranmasında güvenilir, etkin ve kolay bir şekilde kullanılabileceği bu çalışma ile ispatlanmıştır.

Özet (Çeviri)

2. SUMMARY DETECTION OF MUTATIONS CODING AMINO ACIDS 248 AND 249 OF P53 GENE USING DHPLC METHOD Denaturing high-pressure liquid chromatography (DHPLC) is an ion-pair reverse-phase high-pressure liquid chromatography method. DHPLC enables the detection of point mutations and polymorphism based on the heteroduplex formations due to non-paired bases on the PCR amplified DNA duplexes. As being a relatively cheap, effective, reproducible, DHPLC is becoming a routine laboratory technique. In this study, the HPLC system at TÜBİTAK, Marmara Research Center, Research Institute for Genetic Engineering and Biotechnology was modified to be used in DHPLC analysis. The usage of 300-nucleotide long P53 gene region containing known point mutations in codons 248 and 249 proved the efficiency and reproducibility of the system. The native and mutant forms of P53 gene region of 300 nucleotide long, cloned between BamHI and Spel restriction enzyme sites of pBluescript II SK(+) plasmid, were amplified by using gene specific primers. After denaturation by heating, the native and mutant forms were mixed to form homo and heteroduplexes. Denaturing column temperature was determined as 58°C using“the DHPLC Melt Program”. The optimum flow rate of 0.6 ml/min was determined by column calibration using pBR322/HaeIII digest. The presence of heteroduplexes in the sample was detected as early eluted and multiple peaks as compared to a single, ideal gausian peak of homoduplexes in the chromatograms of DHPLC analysis under these conditions. This study proved that by a slight modification of HPLC systems at hand, it is possible to make DHPLC analysis to detect polymorphism and point mutations easily, efficiently and reproducibly.

Benzer Tezler

  1. Otozomal resesif geçişli parkinson hastalığında parkin (PARK2) geni mutasyonlarının araştırılması

    Parkin (PARK2) gene mutation analysis in autosomal recessive parkinson disease

    BURCU DURSUN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NİHAN ERGİNEL ÜNALTUNA

  2. Primer hiperlipidemili hastaların değerlendirilmesi ve ailevi hiperkolesterolemili çocuklarda mutasyon taraması

    Evaluation of patients with primary hyperlipidemia and mutation screening in children with familial hypercholesterolemia

    HAYRETTİN HAKAN AYKAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıHacettepe Üniversitesi

    Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ALİ DURSUN

  3. Fotosensitif epilepsilerde klinik ve EEG bulgularının Bromodomaın- Contaınıng Proteın 2 (BRD2) geni ve GABA reseptör alfa 1 alt ünitesi (GABRA1) geni mutasyonları ile ilişkisinin araştırılması

    Investigation of the relation between clinical and EEG symptoms of photosensitive epilepsies with GABA receptor alfa 1 subunit (GABRA1) gene and bromodomain- containing protein 2 (BRD2) gene mutations

    EBRU NUR VANLI- YAVUZ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2009

    Nörolojiİstanbul Üniversitesi

    Nöroloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BETÜL BAYKAN

  4. İki kiral merkezli siklotrifosfazen bileşiklerinin stereojenik özelliklerinin HPLC ve NMR ile belirlenmesi

    Determination of the stereogenic properties of cyclotriphosphazene derivatives containing two equivalent centres of chirality with HPLC and NMR

    BÜNYEMİN ÇOŞUT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    KimyaGebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Kimya Ana Bilim Dalı

    Y.DOÇ.DR. SERKAN YEŞİLOT

  5. PTPN11 gen mutasyonlarının noonan sendromlu hastalarda taranması

    Screening for mutations in the PTPN11 gene in patients with noonan syndrome

    FİLİZ BAŞAK CENGİZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. MUSTAFA TEKİN