Reverz transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu tekniği ile prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) izolatının duyarlı tanısının yapılması ve duyarlığının ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) testi ile karşılaştırılması
Sensitive detection of prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and comparison of the sensitiveness with ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) test
- Tez No: 154799
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. HİKMET MURAT SİPAHİOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Ziraat, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: PNRSV, RT-PCR, DAS-ELISA, karşılaştırma, optimizasyon, PNRSV, RT-PCR, DAS-ELISA, comparison, optimization. Ill
- Yıl: 2004
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yüzüncü Yıl Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 71
Özet
İki farklı teşhis yönteminin (DAS-ELISA ve RT-PCR) odunsu konukçu Prunus mahalefe transfer edilen Malatya izolatı Prunus necrotic ringspot virüsünü (PNRSV) teşhisindeki başansının karşılaştırmalı analizi gerçekleştirilmiştir. RT- PCR testi için total RNA ekstraksiyonu, silika temelli metoda göre taze yaprak, kök, kabuk ve yeşil sürgün kabuğu dokuları kullanarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştınlan RNA, reverz transkripsiyonda cDNA sentezi için kalıp olarak kullanılmıştır. İki farklı primer seti kullanılarak gerçekleştirilen RT-PCR testi sonrasında 616 bp ve 785 bp uzunluğunda çoğaltılan PCR ürünleri, agaroz jel'de koşulmuş ve ethidium bromid ile boyanarak gözlemlenmiştir. ELISA testi ile karşılaştırıldığında PNRSV izolaunı tamda RT-PCR'm daha duyarlı olduğu saptanmıştır. PNRSV izolatmı RT- PCR ile tamda, kullanılacak en iyi dokuyu belirlemek için yapılan çalışmada kök, kabuk ve yeşil sürgün kabuğu dokularına nazaran yaprak dokusunun PNRSV'yi saptamada en iyi bitkisel doku olduğu tespit edilmiştir. PNRSV virüsünün RT-PCR ile tanısında PCR bileşenlerinin reaksiyona olan etkileri araştırılmış ve herbir bileşen için optimum konsantrasyonlar veya miktarlar tespit edilmiştir. Elli mikrolitte hacminde gerçekleştirilen PCR reaksiyonunda en iyi magnezyum kloriir konsantrasyonun 1.25-2.5 mM aralığında, en iyi dNTP konsantrasyonun 1-10 mM aralığında, en iyi Taq DNA polimeraz enzim konsantrasyonun 0.0625-2 ünite/ul aralığında, en iyi primer konsantrasyonun ise 0.2-0.0002 pmol/ul aralığında olduğu tespit edilmiştir. Aynı hacimde gerçekleştirilen PCR reaksiyonunda en iyi cDNA miktarının 1.6-4 ul aralığında olduğu saptanmıştır. PNRSV virüsünün RT-PCR yöntemi ile tanısında elde edilen optimize bileşen konsantrasyonları iklim odası ve arazi koşullarında gelişen infekteli bitkilere uygulandığında virüsün rahat ve güvenilir biçimde tanısının yapılabileceği tespit edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Two methods (DAS-ELISA-RT-PCR) were compared in detection of PNRSV-Malatya isolate from a woody host P. mahaleb. Silica based method was used in total RNA extraction from leaf, root, one year old green bark tissue and bark tissues. Purified RNA was served as template in reverse transcription for complementary DNA (cDNA) synthesis. Two expected size of fragments (616bp and 785bp) of two different primer sets were visualized in agarose gel when staining ethidium bromide solution. RT-PCR was found to be more sensitive detection method comparing ELISA test in detecting PNRSV. Leaf tissue was proved to be more suitable tissue in detection of virus by RT-PCR respect to root, one-year-old green bark tissue and bark tissue. To obtain detailed understanding of various factors influencing the RT-PCR in detection of PNRSV, parameters were optimized. Using a PNRSV isolate with a pair of primer, magnesium chloride, dNTP, primer, Tag DNA polymerase enzyme and cDNA the followings were found: The magnesium chloride concentration should be 1.25-2.250 mM, the dNTP concentration should be 1-10 mM, the primer concentration should be 0.2-0.0002 pmol/ul and the Tag DNA polymerase enzyme concentration should be 0.0625-2 unit/ul and cDNA value should be 1.6-4 ul for 50 fj.1 rection volume. When using optimised values, a clear and reliable detection was performed from growing and field grown PNRSV infected plants.
Benzer Tezler
- Reverz transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu tekniği ile Doğu Anadolu bölgesinde yetiştirilen sert çekirdekli meyve ağaçlarında saptanan apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) izolatlarının duyarlı tanılarının yapılması
Sensitive detection of apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) isolates collected from stone fruits in Eastern Anatolia by using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
BÜLENT POLAT
Yüksek Lisans
Türkçe
2004
ZiraatYüzüncü Yıl ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. HİKMET MURAT SİPAHİOĞLU
- İnfeksiyöz bursal hastalık virusunun revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile teşhisi ve moleküler tiplendirilmesi
Diagnosis of infectious bursal disease virus by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and its molecular characterization
GAZEL AYÇA KURTBEYOĞLU
Doktora
Türkçe
2024
MikrobiyolojiAnkara ÜniversitesiMikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET AKAN
- Revers transkriptaz-PCR tekniği (mRNA analizi) ile talasemiye neden olan mutasyonların alfa ve beta gen ekspresyonları üzerine etkilerinin incelenmesi
An Investigation on the relative expressional levels of alpha and beta mRNA allels by the reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) technique
MUSTAFA MERT SÖZEN
- Arpa (Hordeum vulgare L.) kültür varyetelerinde transpozon ve kromozom analizleri
Transposon and chromosome analysis on barley (Hordeum vulgare L.) culture varieties
SEVGİ MARAKLI
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
Genetikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NERMİN GÖZÜKIRMIZI
- Kolorektal kanserli vakalarda Wnt-2 ve HOX 2G genlerin transkripsiyonlarının incelenmesi
Investigation of Wnt-2 and HOX 2G genes transcription in cases of colorectal cancers
HANDAN POLAT