Geri Dön

Analysis of self-processing mechanism of galactose oxidase by site-directed mutagenesis and heterologous expression in Escherichia coli

Galaktoz oksidazın kendini işleme mekanizmasının alan-hedefli mutajenezle analizi ve Escherichia colide heterolog ekspresyonu

  1. Tez No: 166997
  2. Yazar: BURÇAK GENÇER
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL, PROF. DR. MİCHAEL MCPHERSON
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Galaktoz Oksidaz, pro-peptide, kendi kendine işlenme, otokatalitik kesim, alan- hedefli mutajenez. vıı, Galactose Oxidase, pro-peptide, self-processing, autocatalytic cleavage, site-directed mutagenesis
  7. Yıl: 2005
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 172

Özet

öz GALAKTOZ OKSİDAZIN KENDİNİ İŞLEME MEKANİZMASININ ALAN- HEDEFLİ MUTAJENEZLE ANALİZİ VE ESCHERICHIA COU 'DE HETEROLOG EKSPRES YONU Gençer, Burçak Yüksek Lisans, Biyoteknoloji Bölümü Tez Danışmanı: Prof. Dr. Zümrüt Begüm Ögel Yardımcı Tez Danışmanı: Prof. Dr. Michael J. McPherson Aralık 2005, 153 sayfa Bu çalışmada E.coli 'de heterolog olarak ifade edilen pro-galaktoz oksidazın kendi kendini katalizleyen olgunlaşma mekanizması, pro-peptidin uzaklaştırılmasında önemli rolü olduğu düşünülen bazı amino asitler değiştirilerek analiz edilmiştir. Fusarium graminearum kökenli galaktoz oksidaz (GOase; EC 1.1.3.9) 68kDa moleküler kütleye sahip, monomerik, alışılmadık bir tiyoeter bağına sahip bakır içeren bir enzimdir. Enzim N-terminalinde 8 amino asiüik ilave pre-peptide ve 17 amino asitlik pro-sekansa sahip bir öncü olarak üretilir.Daha önceki çalışmalar, pre- peptidin salgılanma sırasında muhtemelen bir proteazla uzaklaştırıldığını, buna karşılık 17 amino asitlik pro-peptidin de bakırın aerobik olarak öncüye ilavesiyle aktif bölgede tiyoeter bağı oluşumu öncesinde otokatalitik olarak ayrıldığını göstermektedir, pro-gao geni daha önceden İngiltere'de yönlendirilmiş evrim ile pETl01/D/lacZ vektöründe oluşturulan ProGONİ ve ProGOMNİ yapılan üzerindedir. ProGOMNİ yüksek ekspresyonu sağlamak üzere işlenmiş enzimde ileri vıaltı mutasyona daha sahipken, ProGONİ yaban galaktoz oksidazdan farklı olarak yalnızca N-terminalinde anlamsız mutasyonlar İçerir. Kesim bölgesi mutasyonları R-1P/A1P, R-1X/A1X, S2A; ve üç boyutlu konfıgürasyonda kesim bölgesinin tam karşısında bulunan H522A mutasyonu, alan-hedefli mutajenez ile gerçekleştirilmiştir.Bunlar ve meydana gelen bazı ekstra mutasyonlar DNA dizi analiziyle doğrulanmıştır.Daha sonra, Kcoli BL21 Star (DE3)'de ifade edilen mutant galaktoz oksidazlar afinite kromatografisi esasına göre çalışan Strep-Tactin® Sepharose® kolonu ile saflaşurılmıştır. Ardından, pro-sekans varlığı ya da yokluğundan kaynaklanan protein bantlarının moleküler kütle farkı tespit edilerek, kendi kendine işlenme analiz edilmiştir. SDS-PAGE sonucu elde edilen bantlar karşılaştırıldığında, orijinal rekombinant plazmitler, yani ProGONİ, ProGOMNİ; ve mutasyonal varyant ürünlerinin 70kDa'nın biraz üzerinde bulunup tüm yapılarda pro- sekans varlığına işaret ederek bant boyutlarının hiçbir fark göstermediği görülmüştür. Mutant olmayanlar ve bazı mutantlar, tiyoeter bağı oluşumuyla uygun aktif bölgenin oluştuğuna dikkat çekerek galaktoz oksidaz aktivitesi göstermiştir.70 kDa'nın üstündeki bir boyutun yalnızca C-terminaldeki 1 kDa'lık Strep-tag II 'den kaynaklanmış olamayacağım kesinlikle belirtebilmek için ProGOMNİ N-terminal amino asit dizilemesine gönderilmiştir. Dizileme verileri, N-terminalde işlenme gerçekleşmediğini gösteren pre-peptid ve pro-peptid varlığım onaylamıştır.Bu nedenle, bu çalışmada galaktoz oksidazın N-terminalindeki pre-pro-peptid varlığının aktif bölgede tiyoeter bağı oluşumunu engellemediği ilk kez gösterilmiştir. Üstelik, pro-peptid otokatalitik olarak kesildiğinden, Cu2+ ve oksijen varlığında Kcoli" de pre- peptidin uzaklaştırılamaması, pro-peptid kesiminin gerçekleşmemesi için çok olası bir sebeptir. İleriki çalışmalarda bu hipotezi kanıtlamak için pre-peptid bölgesi çıkarılacaktır.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT ANALYSIS OF SELF-PROCESSING MECHANISM OF GALACTOSE OXIDASE BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS AND HETEROLOGOUS EXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI Gençer, Burçak M.S., Department of Biotechnology Supervisor: Prof. Dr. Zümrüt Begüm Ögel Co-Supervisor: Prof. Dr.Michael J. McPherson December 2005, 153 pages In this study, self-catalytic maturation of heterologously expressed pro-galactose oxidase was analysed in E.coli by altering some amino acids which were supposed to play a crucial role in pro-peptide removal. Galactose oxidase (GOase; EC 1.1.3.9) from Fusarium graminearum; having a molecular mass of 68kDa, is a monomelic, copper containing enzyme with an unusual thioether bond. The enzyme is produced as a precursor with an additional 8 amino acid pre- and a 17- amino acid pro- sequence at the N terminus. Previous work has shown that the pre-peptide is removed possibly by a protease during secretion, whereas the 17 amino acid pro peptide is removed autocatalytically by the aerobic addition of Cu2+ to the precursor, preceding the formation of the thioether bond at the active site. The pro-gao gene was on ProGONl and ProGOMNl constructs which were previously established on pET101/D/ibcZ vector in England by directed evolution. ProGONl contains silent mutations at the N-terminus different from native galactose oxidase whereas IVProGOMNl has six further mutations within the mature enzyme, providing high expression. The cleavage site mutations R-1P/A1P, R-1X/A1X, S2A, and the H522A mutation just against the cleavage site in the three dimensional configuration, were carried out by site-directed mutagenesis. Those and some extra mutations were confirmed by DNA sequence analysis. Next, mutant galactose oxidases were expressed in E. coli BL21 Star (DE3), and were purified by Strep-"! actin® Sepharose® column, operating on the basis of affinity chromatography. Subsequently, SDS-PAGE was performed to analyze self-processing by detecting molecular mass difference of protein bands resulting from pro-sequence removal or existence. When the bands obtained in SDS-PAGE were compared, it was seen that the products of original recombinant plasmids, i.e. ProGONl, ProGOMNl; and the mutational variants showed no difference in band size, all slightly above 70kDa; indicating pro-sequence presence on all constructs. Non-mutants and some of the mutants showed galactose oxidase activity, signifying proper active site construction by thioether bond formation. ProGOMNl was submitted for N-terminal amino acid sequencing to be able to assert that a size above 70kDa is not solely due to the existence of a 1 kDa Strep-tag U at C-terminus. Sequencing data affirmed the presence of both the pre-peptide and the pro-preptide showing that processing has not occurred at the N-terminus. Accordingly, in this study, it was shown for the first time that the existence of a pre-pro-peptide at the N-terminus of galactose oxidase does not prevent thioether bond formation at the active site. Furthermore, since the pro-peptide is cleaved autocatalytically, the lack of removal of the pre-peptide in Rcoli in the presence of Cu 2+ and oxygen is very likely to be the cause of lack of pro-peptide cleavage. In future studies the region corresponding to the pre-peptide will be deleted to prove this hypothesis.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    338297

    Deletion mutagenesis of fusarium graminearum NRRL 2903 galactose oxidase in Escherichia coli to study structure-function relations and for prospective biosensor applications

    Fusarium graminearum nrrl 2903 galaktoz oksidazının yapı-işlev ilişkilerinin ve ileriye dönük biyosensör uygulamalarının araştırılması için Escherichia coli'de delesyon mutajenezi çalışmaları

    BURÇAK KOCUKLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL

    PROF. DR. UFUK BÖLÜKBAŞI

  2. Tez No

    497895

    Neurophysiological mechanism of attachment style: Event-related potential study during facial expression processing

    Yetişkin bağlanma stillerinin nörofizyolojik temelleri: Yüz ifadelerinin işlenmesi sırasında olay-ilişkili beyin potansiyellerinin (ÖİP) değerlendirilmesi

    SİMGE ŞAHİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    PsikolojiBahçeşehir Üniversitesi

    Klinik Psikoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. METEHAN IRAK

  3. Tez No

    66398

    İmalat sistemlerinin tasarlanması ve öncelik kurallarının belirlenmesinde yapay sinir ağlarının kullanılması

    Başlık çevirisi yok

    TARIK ÇAKAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1997

    Mühendislik Bilimleriİstanbul Teknik Üniversitesi

    İşletme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYHAN TORAMAN

  4. Tez No

    363555

    Self-tuning structures of interval Type-2 fuzzy PID controllers

    Aralık değerli Tip-2 bulanık PID kontrolörler için öz-ayarlama yapıları

    AHMET SAKALLI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kontrol ve Otomasyon Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ENGİN YEŞİL

  5. Tez No

    745667

    Effects of stimulus type on eye movement measures during mindless reading and mindless listening

    Uyaran türlerinin okuma sırasında zihinsel gezinme ve dinleme sırasında zihinsel gezinmedeki göz hareketleri ölçümleri üzerindeki etkisi

    MEHTAP ÇAKIR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    DilbilimYeditepe Üniversitesi

    Bilişsel Bilimler Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ FUNDA YILDIRIM

Geri Dön