Geri Dön

İnfluenza A ve B virus RNA'sının RT-PZT yöntemiyle saptanması

Determination of influenza A and B virus RNA by RT-PCR method

  1. Tez No: 171956
  2. Yazar: GÜLİZ DOĞAN
  3. Danışmanlar: DOÇ.DR. ARZU SAYINER
  4. Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2006
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
  10. Enstitü: Tıp Fakültesi
  11. Ana Bilim Dalı: Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 108

Özet

l.ÖZET influenza A ve B Virus RNA' sının RT-PZT Yöntemiyle Saptanması Dr. Güliz Doğan Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD İnciraltı/İzmir Amaç ve Hipotez: Influenza virus, akut solunum sistemi infeksiyonlarına neden olan viral ajanlar arasında sık görülenlerden ve salgınlara yol açan etkenlerden biridir. Bu infeksiyonu klinik olarak diğer solunum sistemi patojenlerinin yaptığı solunum sistemi infeksiyonundan ayırmak zordur, influenza virusların erken tanısı klinik ve epidemiyolojik açıdan önemlidir. Tedavi ve riskli kişilerin korunması için kullanılan antiviral ajanlar, semptomlar başladıktan sonra en geç 24-48 saat içerisinde alınırsa klinik yarar sağlamaktadır. Ayrıca, erken tanı ile gereksiz tetkikler, gereksiz antibiyotik tedavisi önlenerek ve hastanede kalış süresi azaltılarak maddi tasarruf sağlanabilmekte, antibiyotik kullanımının neden olduğu yan etkiler ve direnç sorunları önlenebilmektedir. Çalışmada, influenza virusların hızlı, duyarlı ve özgül tanısını sağlayacak, rutin kullanıma uygun gerçek zamanlı RT-PZT esaslı bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Akut solunum yolu infeksiyonu tanısı alan olgulardan nazofarenjial sürüntü örnekleri toplandı. Olgular, İzmir Bahçelievler semtinde bulunan Kılıçreis Sağlık Ocağı'na başvuranlardan veya Dokuz Eylül Üniversitesi çalışanlarından seçildi. Toplanan 191 örneğin, 101 tanesi Aralık 2003- Mart 2004, 90 tanesi Ekim 2004- Nisan 2005 tarihleri arasında alındı. Hastaların, 44'ünü çocuklar (ortalama yaş: 74.9 ay; 2-192 ay arası), 147'sini erişkinler (ortalama yaş: 42.7 yaş; 17-80 yaş arası) oluşturdu. Hastalar, ani başlayan yüksek ateş, miyalji, baş ağrısı, halsizlik, nonprodüktif öksürük, boğaz ağrısı, burun akıntısı veburun tıkanıklığı yakınmaları açısından sorgulandı. Bu semptomlardan en az üç tanesinin birlikteliği akut solunum yolu infeksiyonu olarak kabul edildi. Sürüntüler, viral transport besiyerinde + 4°C'de taşındı ve alikotlanarak test uygulanana kadar -80°C'de saklandı. RNA izolasyonu High Pure Viral RNA kit (Roche Diagnostics, Germany) ile yapıldı, influenza A ve B RNA tespiti için iki yöntem kullanıldı. Birincisi, RT-PZT ve sonrasında uygulanan plak hibridizasyon - EIA yöntemine dayanan ticari bir kit (Influenza A/B typing OligoDetect, Chemicon International, USA) ikincisi, Schweiger ve ark. çalışması kaynak alınarak geliştirilen gerçek zamanlı RT-PZT testi idi [97]. Gerçek zamanlı RT-PZT testinde, influenza A ve B için ayrı öncül çiftleri ve hidrolize olan problar (TaqMan probu) kullanıldı. Test, influenza A ve B için ayrı ayrı çalışıldı. Ayrıca ilk yıl toplanan 12 ve ikinci yıl toplanan tüm örnekler hücre kültürü yapılması amacıyla kuru buz üzerinde İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Viroloji Laboratuvan'na gönderildi. Her iki RT-PZT'de standardizasyon ve optimizasyon için hücre kültüründe üretilmiş influenza A ve B viruslarından elde edilen RNA kullanıldı. Chemicon RT-PZT testi için, ELA indeksi (örnek OD/cutoff OD) iki ve üstü olan örnekler pozitif kabul edildi. Bulgular: Çalışılan 191 örneğin:. RT-PZT sonrası plak hibridizasyon testiyle: 23'ünde (20'si 2003-2004, 3'ü 2004-2005 sezonunda) influenza A, 4'ünde (hepsi 2004-2005 sezonunda) influenza B RNA' sı tespit edildi. RT-PZT pozitif saptanan örneklerden 17/30'ünde (% 56.6) agaroz jel elektroforezinde de bant saptanırken, 13'ü (% 43.4) sadece hibridizasyon ile tespit edildi. Bir örnekte influenza B virus ile uyumlu bant saptanırken, plak hibridizasyon testi negatif sonuç verdi.. Gerçek zamanlı RT-PZT yöntemiyle: 40'mda (31'i 2003-2004, 9'u 2004-2005 sezonunda) influenza A RNA' sı tespit edildi. Bu yöntemle örneklerin hiçbirinde influenza B virus RNA' sı tespit edilemedi. Amplifikasyonun değerlendirilebilmesi için gerçekleştirilen jel elektroforezinde beş örnekte influenza B ile uyumlu pozitif bant saptandı.influenza virus izolasyonu için hücre kültürü yöntemiyle incelenen 1 02 örneğin;. 13 'ünde influenza A virus (10'u 2003-2004, 3'ü 2004-2005 sezonunda), 13 'ünde influenza B virus (hepsi 2004-2005 sezonunda) üretildi. Sonuç:. Çalışmada kullanılan gerçek zamanlı RT-PZT yöntemi, influenza A virus infeksiyonu tanısında kullanılabilecek hızlı ve güvenilir bir tanı metodu olarak bulunmuştur. Klasik RT-PZT yöntemine göre daha hızlı ve tek tüpte, tüp açılmadan gerçekleştirildiği için kontaminasyon riski daha düşüktür. Her iki RT-PZT yönteminde de internal kontrol kullanılmadığından yalancı negatiftik olasılığı dışlanamamıştır..“Chemicon”RT-PZT yönteminde, pozitif örneklerin yaklaşık olarak 1/3 'ü, ancak plak hibridizasyonu ile saptanmıştır. Plak hibridizasyon basamağı, testin duyarlılığı arttırmıştır.. Influenza B virus için gerçekleştirilen gerçek zamanlı RT-PZT yönteminde, bazı örneklerde amplikonların agaroz jel elektroforezi ile gösterilebilmesi ancak prob hibridizasyonu ile saptanamaması, hibridizasyonda sorun olduğunu göstermiştir. Bu sorun, eksternal kalite kontrol örnekleri ve kültür izolatları ile ortaya çıkmamıştır. Benzer bir sorun“Chemicon”testi ile de bir örnekte saptanmıştır. Amplikon saptanabilen örneklerin dizi analizi ile incelenmesi ve sorunun hedef dizilerdeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığının belirlenmesi planlanmıştır.. Çalışma grubunda, 2003-2004 sezonunda, sadece influenza A virus saptanmış ve Ocak ayında artış gösteren infeksiyona yol açtığı belirlenmiştir. 2004-2005 sezonunda ise influenza A virusa ek olarak influenza B virus olgularının da varlığı belirlenmiştir, influenza A virüsün Ocak ayında artan infeksiyon yaptığı, takip eden Şubat ve Mart aylarında ise influenza B virüsün baskın olarak hastalık oluşturduğu görülmektedir.

Özet (Çeviri)

2.SUMMARY Determination of Influenza A and B Virus RNA by RT-PCR Method Dr. Guliz Dogan Dokuz Eylül University Hospital Faculty of Medicine Clinical Microbiology Departmant Inciralti/Izmir Aim and Hypothesis: Influenza virus is one of the most frequently seen viral agents causing acute respiratory system infection and lead to epidemics. In terms of clinical symptoms, it is difficult to distinguish influenza from other acute respiratory system pathogens. Rapid diagnosis is important for clinical and epidemiological studies. A rapid diagnosis of the infection is essential especially if the treatment is beneficial, since anti-viral drugs must be started within the first 24-48 hours after the onset of the disease. With a rapid diagnosis, the unnecessary tests and antibiotic treatment are avoided; money saved due to the decrease of the hospitalization period and side effects and resistance due to the use of antibiotics is prohibited. This study aimed to develop a real-time RT-PCR assay that can be used for rapid, sensitive and specific diagnosis of influenza A and B infections on clinical samples. Method: Nasopharyngeal swab samples were collected from patients with acute respiratory infection. Patients were chosen from Primary Health Care Center of Kihncreis District of Izmir and Dokuz Eylul University Hospital. Out of 191 samples, 101 were taken between December 2003 - March 2004, 90 between October 2004 - April 2005. Forty-four of the patients were children (average age: 74.9 months; between 2-192 months), 147 were adults (average age: 42.7 years old; between 17-80 years old). Acute respiratory infection wasdefined as an acute onset accompanied by at least three of the following symptoms: abrupt fever, myalgia, headache, general weakness, dry cough, sore throat and rhinitis. Samples were transported at +4 °C. Aliquots were made and stored at -80°C until use. RNA isolation was made by High Pure Viral RNA kit (Roche Diagnostics, Germany). Two assays were used for detection of influenza A and B virus RNA. First, a commercially available kit, based on RT-PCR and hybridization capture method (Influenza A/B typing OligoDetect, Chemicon International, USA) second, a real-time RT-PCR assay developed based on the study of Schweiger et al. [97]. On the real time RT-PCR assay, separate primer couples and hydrolysis probes (TaqMan probe) were used for separate assays of influenza A and B The standardization and optimization of the RT-PCR assays were done by RNA extracted from influenza A and B viruses isolated by the cell culture. Results of the“Chemicon”assay was evaluated by the EIA index (sample OD/cutoff OD). Samples were accepted positive if their EIA index were > 2. In addition, 12 samples collected in the first year and all samples collected in the second year were sent to virology laboratory of the Istanbul University Medical School of Istanbul, on dry ice for the cell culture isolation.. Results: Out of 191 samples:.“Chemicon”assay results (RT-PCR and hybridization capture assay): 23 samples (20 in 2003-2004, 3 in 2004-2005 season) were found to be positive for influenza A RNA, 4 samples (all in 2004-2005 season) were found to be positive for influenza B virus. 17/30 (56.6%) of the RT-PCR positive samples showed a clear band on agarose gel electrophoresis and gave a positive signal at the plate detection, while 13 (43.4%) could only be detected by hybridization capture assay. On one sample, a clear band on agarose gel electrophoresis compatible with influenza B was seen although the plate hybridization assay was negative.. Real-time RT-PCR assay results: 40 samples ( 3 1 in 2003-2004, 9 in 2004-2005 season) were found to be positive for influenza A RNA. There were no influenza B virus positivity on any of the samples with this assay, although influenza B was isolated from 13 samples by cell culture and four samples were positive for viral RNA by“Chemicon”assay.Amplicons of the real-time PCR assay was evaluated by gel electrophoresis and a positive band compatible with influenza B was found.on five samples.. Cell culture isolation results: Influenza A was isolated from thirteen of the 1 02 samples that were evaluated by cell culture (10 in 2003-2004, 3 in 2004-2005 season). An other 13 samples were influenza B virus ( all in 2004-2005 season) positive. Conclusion:. Real time RT-PCR used in this study was found to be a rapid and practical diagnostic tool for the diagnosis of influenza A virus infection. It is faster, and the risk of contamination is lower since all the steps of the assay can be made in a single tube.. Neither of RT-PCR methods used in the study included internal control, therefore false negativity could not be excluded.. Almost 1/3 of the samples could only be detected by the plate hybridization after the RT-PCR compared to gel electrophoresis on“Chemicon”RT-PCR method. Plate hybridization increased the assay sensitivity as expected.. Influenza B amplicons could be detected with agarose gel electrophoresis but missed by probe hybridization on the developed real-time PCR assay. This problem was not seen when positive controls or external quality control samples were studied by the assay. A similar problem was also detected on another sample with“Chemicon”assay. It is planned to examine these samples by sequence analysis and to determine if the problem is due to the changes in target sequences.. In the study group, only influenza A was found in 2003- 2004 season with a peak of infection in January, 2004. In 2004 - 2005 season, in addition to influenza A"influenza B virus was also detected. Influenza A infections made a peak in January 2005 while, influenza B infections were seen in February and March, 2005. The dominance of the virus type and peak months were in concordance with the European Influenza Surveillance Scheme (EISS) reports of the related season.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    912712

    RSV, ınfluenza ve SARS-COV-2 için multipleks RT-PCR testi validasyonu

    Validation of a multiplex rt-pcr assay for the detection of rsv, influenza and SARS-CoV-2

    ALİHAN BULGURCU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    MikrobiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYÇA ARZU SAYINER

  2. Tez No

    58001

    Sanicula europaea L. ekstrelerinin influenza virus infeksiyonlarına etkileri

    Başlık çevirisi yok

    KADİR TURAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1996

    Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. AVNİ KURU

  3. Tez No

    750285

    Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Hastanesi'nde influenza enfeksiyonu tanısı ile izlenen çocuk hastaların geriye dönük olarak değerlendirilmesi

    Retrospective evaluation of pediatric patients followed up with the diagnosis of influenza infection at Aydin Adnan Menderes University Hospital

    GÜLİN SELİN ÖĞÜTÇÜ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıAdnan Menderes Üniversitesi

    Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SONER SERTAN KARA

  4. Tez No

    815265

    Point-of-care detection of respiratory tract infections using a novel PCR kit with gold nanoparticle-mediated dna polymerase

    Altın nanopartikül aracılığıyla dna polimeraz güçlendirme yöntemi kullanan yeni bir PCR kitinin solunum yolu enfeksiyonlarının yatakta tanısına yönelik kullanımı

    MERT ELMAS

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  5. Tez No

    591692

    Kronik obstrüktif akciğer hastalığı akut alevlenmelerinde solunum yolu virüslerinin moleküler yöntemle araştırılması.

    Molecular detection of respiratory viruses in acute exacerbations of chronic pulmonary disease.

    HAVVA AVCIKÜÇÜK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    MikrobiyolojiGazi Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLENDAM BOZDAYI

Geri Dön