Biochemical characterization of recombinant 20S proteasome from Thermoplasma volcanium and cloning of its regulatory subunit gene
Thermoplasma volcanium, rekombinant 20S proteazomunun biyokimyasal karakterizasyonu ve düzenleyici alt birim geninin klonlanması
- Tez No: 172246
- Danışmanlar: PROF.DR. MAHİNUR AKKAYA, PROF.DR. SEMRA KOCABIYIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: 20S Proteazom, 26S Proteazom düzenleyici alt birim, Klonlama, Thermoplasma volcanium, 20S Proteasome, 26S Proteasome Regulatory Subunit, Cloning, Thermoplasma volcanium
- Yıl: 2006
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bölümü
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 151
Özet
Bu çalışmada termoasidofilik bir arkea olan Thermoplasma volcanium'un rekombinant 20S Proteazom'unun bazı biyokimyasal ve elektroforetik özelliklerinin karakterizasyonu yapılmıştır. SDS-PAGE ile ortaya konulduğu üzere Thermoplasma volcanium 20S Proteazom'u moleküler ağırlıkları sırasıyla 24 kDa ve 23 kDa olan, a- ve |3- olmak üzere iki altbirimden oluşmaktadır. En yüksek kimotriptik aktivite alkali pH aralığında (pH 8.0 - pH 9.0) gözlemlenmiştir ve aktivite için optimum sıcaklık 85°C olarak belirlenmiştir. Proteazom'un ısı stabilitesi oldukça yüksek olup 98°C'de 30 dakika ısıya tabi tutulduktan sonra aktivitenin % 64'ü korunmaktadır. Thermoplasma volcanium Proteazom'una ilişkin en yüksek aktivitenin peptidilglutamil peptidaz aktivitesi olduğu saptanmıştır. viBu proje kapsamında ayrıca, Thermoplasma volcanium'un 26S proteazom'a ilişkin bir düzenleyici alt birim geni de klonlanmıştır. Klonlama için PCR temelli bir yaklaşım izlenmiştir. Thermoplasma volcanium'un kromozomal DNAvsından 26S Proteazom düzenleyici alt birim geninin amplifikasyonu sonucu 1128 bp büyüklüğünde yapısal geni içeren 1419 bp büyüklüğünde bir DNA fragmanı elde edilmiştir. PCR amplikon ile pDrive vektör, E.coli TG-1 hücrelerinde klonlanmıştır. On rekombinant arasından üç tanesi (E.coli pDl-6, E.coli pD2-3, E.coli pD3-l) gerçek rekombinant plazmit olarak belirlenmiş ve restriksiyon haritalaması yolu ile karekterize edilmek üzere seçilmiştir. Rekombinant ve rekombinant olmayan E.coli hücrelerinin, hücre özütünde ATPaz aktiviteleri ölçülmüş ve rekombinant suşlann hücre özütündeki ATPaz aktiviteleri rekombinant olmayana göre on kat daha yüksek bulunmuştur. Bu sonuç ATPaz aktivitesini kodlayan klonlanmış düzenleyici alt ünite geninin E.coli' de başarılı bir şekilde anlatıldığını göstermiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, we have characterized some biochemical and electrophoretic features of recombinant 20S Proteasome from a thermoacidophilic archaeon Thermoplasma volcanium. As revealed by SDS-PAGE the 20S Proteasome was composed of two subunits, a- and P- subunits with estimated molecular masses of 24 kDa and 23 kDa, respectively. The highest chymotryptic activity was observed over an alkaline pH range (pH 8.0 - pH 9.0) and the optimum temperature for the activity was determined as 85°C. The heat stability of proteasome was quite high after treatment at 98°C for 30 minutes, 64 % of the activity has still been retained. The highest activity associated with the Thermoplasma volcanium proteasome was found to be peptidylglutamyl peptidase activity. IVWithin the scope of this project, also, we have cloned a 26S Proteasome related Regulatory Subunit gene of Thermoplasma volcanium. For cloning we have followed a PCR based approach. Amplification of 26S Proteasome Regulatory Subunit gene from chromosomal DNA of Tp. volcanium yielded a product of 1419 bp containing an open reading frame of 1128 bp comprising the structural gene. The PCR amplicon was cloned using pDrive vector in E.coli TG-1 cells. Out of ten putative recombinants, three plasmids, E.coli pDl-6, E.coli pD2-3, E.coli pD3-l, were proved to be true recombinants and selected for further characterization by restriction mapping and expression studies. ATPase activities of cell free extracts from both recombinant and non-recombinant E.coli strains were measured and found that ATPase activities in cell free extracts of recombinant strains were 10 times higher than non-recombinants. This result indicates sucessful expression of the cloned regulatory subunit gene with ATPase activity in E.coli.
Benzer Tezler
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4'ten elde edilen rekombinant glukoz izomerazın bazı özelliklerinin mutasyonla geliştirilmesi
Development of some properties of a recombinant glucose isomerase from Geobacillus caldoxylosilyticus Thermophilic by mutation
ÇİĞDEM AYNA
- Cloning of The Laccase cDNAs from Pycnoporus sanguineus MUCL 38531, Expression in Pichia pastoris and Characterization of Recombinant Laccases
Pycnoporus sanguineus?tan Lakkaz cDNA?larının Klonlanması, Pichia pastoris?te Ekspresyonu ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu
GÜNSELİ KURT GÜR
Doktora
İngilizce
2010
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
- Recombinant Pyrococcus furiosus extracellular alpha-amylase expression in Pichia pastoris
Pyrococcus furiosus hücre dışı alfa-amilaz enziminin rekombinant Pichia pastoris ile ekspresyonu
ERDEM BOY
Yüksek Lisans
İngilizce
2011
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Bölümü
PROF. DR. GÜZİDE ÇALIK
PROF. DR. PINAR ÇALIK
- İnsan Paraoksonaz 1 (pon1) geninin klonlanması, Pichia pastoris'te ekspresyonu, Rekombinant enzimin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Human Paraoxonase 1 (pon1) gene cloning, expression in Pichia pastoris, purification and characterization of Recombinant enzyme
YAĞMUR ÜNVER
Doktora
Türkçe
2014
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ESABİ BAŞARAN KURBANOĞLU
PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN
- Geobacillus kaustaphilus alfa-galaktosidaz enziminin rekombinant protein olarak E. coli'de ifadesi ve karakterizasyonu
Expression and characterization of geobacillus kaustophilus alfagalactosidase enzyme as a recombinant protein in E. coli
ASLI KUŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyomühendislikKafkas ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ YUNUS ENSARİ