Cloning and expression of benzaldehyde lyase gene from pseudomonas fluorescens biovar i in Pichia pastoris
Pseudomonas fluorescens biovar I benzaldehit liyaz geninin Pichia pastoris mikroorganizmasına klonlanması ve ekspresiyonu
- Tez No: 181023
- Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. TUNÇER ÖZDAMAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: P.pastoris, P.pastoris
- Yıl: 2006
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 166
Özet
Pseudomonas fluorescens Biovar I mikroorganizmasının benzaldehit liyaz (BAL,EC 4.1.2.38) tiamin difosfat bağımlı enzimi C-C bağlarının yapımı ve yıkımındagörevlidir. Bu çalışmada, Pseudomonas fluorescens Biovar I benzaldehit liyazgeninin, benzaldehit liyaz enzimin hücredışı üretimi amacı ile Pichia pastorismayasına klonlanması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, polimeraz zincirtepkimesiyle çoğaltılan bal geni pPICZalphaA entegrasyon vektörüne aktarılmış,ve oluşturulan rekombinant pPICZalphaA::bal plazmidi P.pastoris hücresineaktarılmış ve gen P.pastoris kromozomuna integre edilmiştir. Hücredışıbenzaldehit liyaz enzimi P.pastoris hücresinde AOX promotorunun kontrolüaltında üretilmiş ve S. cerevisiae alpha faktör sinyal sekansı ile hücredışınaaktarılmıştır. Rekombinant P.pastoris hücresi önce zeosin içeren katıbesiyerinde 48-72 saat çoğalmış ve oluşan tek kolonilerden gliserol içeren önbesi ortamına aktarılıp 24 saat boyunca çoğalmışlardır. Bu işlemden sonrahücreler santrifüjlenerek ayrılmış ve metanol içeren üretim ortamında 72 sboyunca her 24 saatte bir metanol ile indüklenmişlerdir. SDS-PAGE analizleriderekombinant P.pastoris türü tarafından hücredışı üretilen benzaldehit liyazenzim monomerinin 59 kDa büyüklüğünde olduğu görülmüştür. FPLC analiziüretim ortamında enzimin tetramer formunun monomer formundan çok daha azmiktar bulunduğunu göstermiştir.Benzaldehit Liyaz, Hücredışı üretim, Rekombinant
Özet (Çeviri)
Benzaldehyde lyase (BAL, EC 4.1.2.38) from Pseudomonas fluorescens Biovar I,a thiamine pyrophosphate (ThDP) dependent enzyme, catalyzes the enzymatickinetic resolution of racemates by C-C bond cleavage and concomitant C-Cbond formation. In this study, benzaldehyde lyase gene from Pseudomonasfluorescens Biovar I was cloned into Pichia pastoris, with the aim of theextracellular production of the enzyme. For this purpose, firstly, PCR amplifiedbal gene was cloned into an integration vector pPICZalphaA. Thereafter therecombinant plasmid pPICZalphaA::bal was transformed into P.pastoris.Extracellular benzaldehyde lyase enzyme was expressed under the control ofthe strong AOX promoter and the secretion of the enzyme in the fermentationmedium was achieved by means of S. cerevisiae α factor signal sequence. Therecombinant cells were grown for 48-72 hours in YPD solid medium then thecells inoculated in glycerol containing medium. After being separated bycentrifugation cells were transferred into methanol containing productionmedium. In methanol containing medium cells were grown for 72 h. Startingfrom t=24 h methanol was added to medium as an inducer of AOX promoterand the carbon source of microorganism in order to produce BAL in every 24hour. SDS-PAGE analyses illustrated that extracellular benzaldehyde lyaseenzyme produced by the recombinant P.pastoris strain had the size of 59 KDa,which is the size of benzaldehyde lyase monomer. FPLC analysis showed thatconcentration of the tetrameric form of benzaldehyde lyase enzyme, activeform, was much less than the monomeric form of the enzyme indicating thatthe enzyme produced by recombinant P.pastoris mostly could not fold intomultimeric form in the fermentation medium.Benzaldehyde lyase, Extracellular production, Recombinant
Benzer Tezler
- Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli
TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu
ELİF ÖZKIRIMLI
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı guanozintrifosfat siklohidrolaz-I geninin klonlanması ve ekspresyonu
Cloning and expression of guanosintriphosphate cyclohydrolase-I from anoxybacillus flavithermus
ÖZLEM HIZAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyoteknolojiRecep Tayyip Erdoğan ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FATİH Ş. BERİŞ
- ATP-bağımlı ftsH geninin Geobacillus kaustophilus'dan klonlanması ve ekspresyonu
Cloning and expression of ATP-dependent ftsH gene from Geobacillus kaustophilus
AHMET TÜLEK
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR
- Cloning and expression of the pseudomonas KE38 extra-cellular lipase gene in E. coli
Pseudomonas KE38 hücre dışı lipaz geninin klonlanması ve E. coli'de ifadelenmesi
FULYA KARAKAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ALPER ARSLANOĞLU
YRD. DOÇ. DR. H. ÇAĞLAR KARAKAYA
- İnsan büyüme hormonunun (BH-N) klonlanması, ekspresyonu ve izole büyüme hormonu eksikliği sendromunun genetik karakterizasyonu
Cloning and expression of the human growth hormone (GH-N) and genetic characterization of the isolated growth hormone deficiency syndrome
AJDA ÇOKER