Bölge yönelimli mutagenez yaklaşımı ile insan bütirilkolinesterazında yapı-aktivite ilişkilerinin incelenmesi
Determination of structure-activity relationships of human butyrylcholinesterase by site-directed mutagenesis.
- Tez No: 267348
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÖZDEN TACAL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Eczacılık ve Farmakoloji, Biochemistry, Pharmacy and Pharmacology
- Anahtar Kelimeler: Bütirilkolinesteraz, bölge yönelimli mutagenez, malakit yeşili, metil yeşili, pararozanilin, enzim inhibisyonu, Butyrylcholinesterase, site-directed mutagenesis, malachite green, methyl green, pararosaniline, enzyme inhibition
- Yıl: 2010
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 103
Özet
İnsan bütirilkolinesterazının (BChE) yapı-aktivite ilişkisini incelemek ve katyonik triarilmetan (TAM+) yapılı boyaların enzim üzerindeki bağlantı noktalarını araştırmak amacıyla; bölge yönelimli mutagenez yöntemi kullanılarak insan BChE'ının aktif merkez oyuğunda veya yakın çevresinde nokta mutasyonları yapıldı. Katyonik triarilmetan yapılı boyaların [malakit yeşili (MG), metil yeşili (MeG), pararozanilin (PR)] rekombinant doğal-tip ve BChE mutantları (A277V, P285L, P382A, H214Q, H77L, F329A) üzerindeki inhibitör etkileri, spektrofotometrik olarak 25 °C'de, 50 mM MOPS (pH 8) ortamında, 0.125 mM 5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit), 0.05-0.4 mM bütiriltiyokolin (BTC) ve 0-64 µM ligand kullanılarak araştırıldı. Yapılan kinetik değerlendirmeler sonucunda PR'nin rekombinant doğal tip ve tüm mutant enzimler üzerinde çoklu bağlanma ile uyumlu sonuçlar verdiği bulundu. MG ve MeG, F329A mutantı dışında rekombinant doğal tip ve BChE mutantlarında lineer karışık veya kompetitif inhibisyona neden oldu. Ki değerleri açısından karşılaştırıldıklarında rekombinant doğal tip ve BChE mutantlarının (F329A hariç) MG ve MeG'ne benzer afinite gösterdikleri bulundu.. MG ve MeG, F329A BChE mutantı üzerinde ise iki bölgeye bağlanmaya işaret eden nonlineer inhibisyona neden oldu. MG ve MeG ile F329A'nin inhibisyonundaki Ki değerleri sırasıyla; 3.8 µM ve 27 µM olup; rekombinant doğal tip BChE'a göre ? 50 (MG) ve 150 (MeG) kat daha zayıf bağlandığı bulundu. MG ve MeG ile F329A mutantının inhibisyonu sonucunda hem inhibisyon paterninin değişmesi hem de inhibitör etkinin azalması, her iki ligandın F329A mutantı üzerinde bağlandığı bölgelerden birinin (aktif bölge oyuğu ya da periferal anyonik bölge) pi-pi (veya katyon-pi) etkileşimlerinin bozulması nedeniyle devre dışı kaldığı ve ikinci bağlama bölgesi olarak da her iki ligandın farklı bir yere bağlandığını düşündürdü. Bu bulgular göz önüne alındığında, MG ve MeG'in insan BChE'ına bağlanmasında 329. pozisyondaki fenilalaninin çok önemli bir amino asit olduğu sonucuna varıldı.
Özet (Çeviri)
To determine structure-activity relationships of human BChE and to explore binding points of cationic triarylmethane dyes on enzyme, point mutations were created at or near the active site gorge of human butyrylcholinesterase (BChE) by site-directed mutagenesis The inhibitory effects of cationic triarylmethanes [malachite green (MG), methyl gren (MeG), pararosaniline (PR)] on recombinant wild type and mutant BChEs (A277V, P285L, P382A, H214Q, H77L, F329A) were spectrophotometrically studied at 25 °C, in 50 mM MOPS buffer pH 8, using 0.125 mM 5,5?-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.05-0.4 mM butyrylthiocholine and 0-64 µM ligand. Kinetic analyses yielded the following information: With recombinant wild type and mutant BChEs, PR was found to yield results pointing to multiple bindings. MG and MeG caused linear mixed or competitive inhibition of recombinant wild type and BChE mutants except F329A. By comparing the Ki values, it was found that both recombinant wild type and mutant BChEs (except F329A) showed similar affinity against MG and MeG. With F329A, MG and MeG caused complex, nonlinear inhibition pointing to cooperative binding at two sites. The Ki values for inhibition of F329A by MG and MeG were 3.8 µM and 27 µM, respectively and it was found that these ligands bind ? 50-fold (for MG) and 150-fold (for MeG) weaker than recombinant wild type BChE. Change of inhibition pattern and also reduction in inhibitor effect due to inhibition of F329A by MG and MeG, made us assume that because of impairment of pi-pi (or cation- pi) interactions, one of the binding points of both ligands on F329A mutant becomes functionally off and both ligands bind different points as secondary binding sites. Considering these results, it was concluded that phenylalanine at position 329 is a critical amino acid in binding of MG and MeG to human BChE.
Benzer Tezler
- Protein engineering applications on novel hAGEst enzyme for changing substrate specificity
Özgün hAGEst enziminin substrat özgüllüğünün değiştirilmesine yönelik protein mühendisliği uygulamaları
EREN BÜYÜKYAVUZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Scytalidium thermophilum çift aktiviteli katalaz-fenol oksidazın (CATPO) katalitik etkinliğinin arttırılması
Increasing the catalytic effectiveness of a bifunctional catalase-phenol oxidase (CATPO) from Scytalidium thermophilum
ÇİĞDEM AKÇAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyokimyaKocaeli ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ
- Fenoksazin ve fenotiyazin yapılı ligandların insan bütirilkolinesterazına bağlanma noktalarının bölge yönelimli mutagenez yöntemi ile araştırılması.
Investigation of binding sites of phenoxazine and phenothiazine structured ligands on human butyrylcholinesterase by site-directed mutagenesis.
ZEYNEP SEZGİN
- İnsan karbonik anhidraz ıı enziminin (hCA II) klonlanması, E. coli'de ekspresyonu, karakterizasyonu, yönlendirilmiş mutagenez ile mutant hCA II genlerinin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning, expression in E. coli, characterization of human carbonic anhydrase ii (hCA II) enzyme, production of mutant hCA II genes by site directed mutagenesis and investigation of affinity of mutant proteins to inhibitors
DERYANUR KILIÇ
- Consequences of site-directed mutations in the helicase domains of the cockayne syndrome group B gene
Başlık çevirisi yok
MELTEM MÜFTÜOĞLU
Doktora
Türkçe
2001
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
DR. VİLHELM A. BOHR
PROF.DR. NAZMİ ÖZER