Geri Dön

Lipaz geninin termofilik Geobacillus kaustophilus'tan klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması

Cloning, expression and purification of thermophilic lipase from Geobacillus kaustophilus

PDF İndir

  1. Tez No: 315077
  2. Yazar: DAVUT ERDOĞAN
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü
  10. Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 102

Özet

Bu çalışmada, Geobacillus kaustophilus'ta bulunan tahmini lipaz geni uygun primerler ile PCR kullanılarak çoğaltılmıştır. PCR ürünleri NdeI ve HindIII enzim kesim bölgeleri kullanılarak pET28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlanan lipaz geninin dizisi, dizi analizi ile kontrol edilmiştir. Lipaz genini içeren pET28a(+) ekspresyon vektörü, E.coli BL21(DE3) kompetan hücreleri transforme edilmiştir. Rekombinant lipaz ekspresyonu IPTG uyarımı ile yapılıp Ni-NTA afinite kolonu kullanılarak saflaştırması yapılmıştır. His-tag kuyruğu içeren rekombinant lipaz SDS-PAGE analizi yapılarak yaklaşık 45 kDa büyüklüğünde olduğu belirlenmiştir. Elde edilen rekombinant protein, lipaz aktivitesi göstermiştir. Rekombinant lipazın karakterizasyon ölçümleri spektrofotometrik analizler ile pNP türevleri ve hindistan cevizi yağına karşı yapılmıştır. His-tag füzyon lipaz ve his-tag bölgesi içermeyen lipazın optimum sıcaklığı gam arabik içeren reaksiyon ortamında sırasıyla 30 ve 50oC olarak belirlenmiştir. Rekombinant lipaz enzimi maksimum aktivitesi pH 8.0, aktivite kararlılığı ise en yüksek pH 8.5'te gözlemlenmiştir. Gk-lipaz enzimi substrat seçiciliği deneylerinde ise orta uzunluktaki sentetik substratları daha iyi hidroliz ettiği belirlenmiştir. Buna benzer olarak bitkisel yağlarla yapılan aktivite deneylerde ise yapısında çoğunlukla C-10 ve C-12 içeren hindistan cevizi yağının lipaz tarafından hidrolizinin diğer yağlara göre daha fazla olduğu belirlenmiştir. DTT ve PMSF içeren reaksiyon ortamında lipaz aktivitesinin sırasıyla %22 ve %33 oranında inhibe edildiği gözlemlenmiştir.

Özet (Çeviri)

In this study, a putative lipase gene in the genome of Geobacillus kaustophilus was amplified using PCR with appropriate primers. The PCR product was cloned into the NdeI and HindIII cloning sites of pET28a(+) expression vector. Its DNA sequence was confirmed by DNA sequencing. The pET28a(+) vector containing the lipase gene was transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells. The overexpression of the recombinant lipase was achieved by IPTG induction and it was purified by using Ni-NTA affinity column. The molecular weight of the recombinant lipase including his-tag tail was determined as nearly 45 kDa on SDS-PAGE analysis. The recombinant enzyme showed lipase activity. The activity experiment of the recombinant lipase was determined using a spectrophotometric assay against p-NP derivatives and coconut oil. Optimum temperature for his-tag fusion lipase and lipase lack of his-tag tail activity with gum arabic was observed at 30 oC and 50oC respectively. Recombinant lipase enzyme showed maximum activity pH 8.0 and was stable at pH 8.5. With the use of p-NP derivatives as substrates, Geobacillus kaustophilus lipase exhibit high activity with C-10 and C-12 acyl groups. Like synthetic specificity, the study of real oil indicated that preferential substrate of Gk-lipase hydrolysis is coconut oil having more C-10 and C-12 group. G.kaustophilus lipase activity was inhibited by DTT and PMSF approximately 22% and 33%, respectively.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    662696

    Discovery of novel enzymes using proteomic approaches

    Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi

    MERVE ÖZTUĞ KILINÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ

  2. Tez No

    270664

    Anoxybacillus sp. Pdf1 lipaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu

    Cloning, expression and characterisation of lipase from Anoxybacillus sp. Pdf1

    FULYA AY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ

  3. Tez No

    342973

    Cloning and expression of the pseudomonas KE38 extra-cellular lipase gene in E. coli

    Pseudomonas KE38 hücre dışı lipaz geninin klonlanması ve E. coli'de ifadelenmesi

    FULYA KARAKAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ALPER ARSLANOĞLU

    YRD. DOÇ. DR. H. ÇAĞLAR KARAKAYA

  4. Tez No

    315508

    Aktinomiset kaynaklı lipaz geninin klonlanması, dizilenmesi ve ekspresyonu

    Cloning, sequencing and expression of actinomycetes lipase gene

    GİZEM ARIK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    MikrobiyolojiAnadolu Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NALAN YILMAZ SARIÖZLÜ

  5. Tez No

    342784

    Shewanella putrefaciens bakterisinden alpha,ß-hydrolase geninin klonlanması ve lipaz aktivitesinin araştırılması

    Molecular cloning, expression and purification of alpha,ß-hydrolase gene for lipase activity from Shewanella putrefaciens

    MOHAMMAD KAIFEE ARMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyomühendislikFatih Üniversitesi

    Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. FAHRİ AKBAŞ

Geri Dön