Rekombinant Escherichia coli soylarında penisilin asilaz ekspresyonunun akılcı tasarım ile iyileştirilmesi
Improvement of penicillin g acylase expression by rational design in recombinant Escherichia coli strains
- Tez No: 315079
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2012
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 202
Özet
Penisilin asilaz (PA) yarı sentetik antibiyotiklerin üretimi sürecinde penisilin G'den 6-aminopenisillanik asit üretmede kullanılan endüstriyel olarak önemli bir enzimdir. E. coli'nin periplazmasında PA'nın olgunlaşması için translokasyon ve periplazmik işlenme/katlanma adımlarını içeren prokaryotik proteinlerde pek görül-meyen bir takım translasyon sonrası basamaklar gereklidir. Enzimin üretimi pac geni ekspresyonunun çeşitli adımlarıyla ilgili tamamlanmamış genetik bilgi nedeniyle hala sınırlı olduğundan, PA üretimini artıracak etkili ekspresyon stratejilerinin gel-iştirilmesi önemlidir.Bakterilerde translasyonun başlaması genellikle translasyonun hız-sınırlayıcı basamağı olarak göz önünde tutulmakta olup, bir genin ekspresyon düzeyinin belir-lenmesinde temel bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada pac geni translasyona başlama bölgesinde (TIR) tercih edilen nükleotit tipi ve pozisyonlarını belirlemek amacıyla bu bölgeye bazı mutasyonlar yerleştirilmiştir. Mutasyonların oluşturulmasında PCR mutagenez yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen mutantların tamamı 26 °C'ta yaban tipe görece daha yüksek bir enzim aktivitesi verirken; 37 °C'ta pac mRNA'sının sı-caklığa duyarlı translasyonu değişmemiştir. Bu sonuç pac geni yaban tipi dizisinin maksimum ekspresyonu sağlamadığına ve translasyona başlama bölgesinin nükleotit içeriğinde yapılacak değişikliklerin aktif PA üretimini iyileştirilebileceğine dikkat çekmiştir. Uyarımlı ve konstitütif olarak gerçekleştirilen ekspresyon çalışmalarında, enzim aktivitesi sadece IPTG uyarımlı koşullarda ve pac3.5-kb fragmanını taşıyan klonları içeren rekombinant soyların kullanıldığı durumda elde edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada beklenmedik bir şekilde daha önce bildirilenlerin aksine PA'nın pe-riplazmaya taşınması için sadece Twin arginin translokasyon yolağına gereksinim duymadığı da gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
Penicillin G acylase is an industrially important enzyme for production of 6-aminopenicillanic acid from penicillin G during the manufacturing of semisynthetic antibiotics. Formation of mature PA in the periplasm of E. coli involves a series of post-translational steps including translocation and periplasmic processing/folding steps, which are unique for prokaryotic proteins. Production of PA is still limited mainly due to the incomplete genetic information existing on various steps of pac gene expression and therefore, it is important to develop efficent expression strate-gies in order to enhance PA production.Initiation of translation in bacteria is generally considered as a rate-limiting step of translation and it has main role on determination of the overall expression level of a gene. In this work, some mutations are introduced into translation initiation region (TIR) of pac gene in order to identify the prefered nucleotides and positions in this region. Mutations were performed by PCR-mutagenesis. All of the mutants gave higher level of enzyme activity in comparison to wild-type sequence at 26 °C while no change occured in the temperature-sensitive translation of pac mRNA at 37 °C. This result indicates that wild-type pac gene sequence does not give maximum level of gene expression and alteration of the nucleotide context of TIR of pac gene could improve the active enzyme production.Enzyme activity was only found in strains that contain clones carrying pac gene in 3.5-kb fragment with IPTG induction conditions in expression studies that were carried out constitutively and by induction. Unexpectedly, our study also re-vealed that translocation of PA, in contrast to earlier reports, did not require only the Twin-arginine translocation pathway for its transport into the periplasm.
Benzer Tezler
- Penisilin asilaz üreten rekombinant E.coli soylarında gen ekspresyonu, enzimin saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Gene expression in penicillin acylase producing recombinant E.coli strains, purification and characterization of the enzyme
HÜLYA AKDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoloji Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
- Rekombinant soylarda penisilin asilaz üretkenliği ve niteliklerinin yönlendirilmiş evrim ile iyileştirilmesi
Improvement of productivity and properties of penicillin acylase producing recombinant strains by directed evolution
HÜSEYİN BALCI
Doktora
Türkçe
2015
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
- Nalidiksik asit ve uv ışığı uygulamasının escherichia coli K12 şuşlarında DNA onarımı ve rekombinasyona etkileri
Effects of UV light and nolidixic acid treatment and DNA repair and rocambination on escherichia coli K12 strains
SÜHEYLA İNAN
- Influence of oxygen transfer on benzaldehyde lyase production by recombinant Escherichia coli BL21(DE3) pLySs
Rekombinant Escherichia coli BL21(DE3) pLySs ile oksijen aktarımının benzaldehit liyaz üretimine etkisi
VAHİDEH ANGARDİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2007
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PINAR ÇALIK
PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR
- Feeding strategy development for benzaldehyde lyase production by recombinant Escherichia coli BL21
Rekombinant Escherichia coli BL21 ile benzaldehit liyaz üretimi için besleme stratejisi geliştirilmesi
HANDE LEVENT
Yüksek Lisans
İngilizce
2008
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Bölümü
PROF. DR. PINAR ÇALIK