Development of sandwich type nucleic acid array platform for the detection of microRNAs in breast cancer
Meme kanseri tespiti için sandviç tabanlı nükleik asit dizi platformunun geliştirilmesi
- Tez No: 385112
- Danışmanlar: PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Bilim ve Teknoloji, Biyoloji, Biyoteknoloji, Science and Technology, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 165
Özet
MikroRNA'ların gelişim ve farklılaşma yolakları, metabolizmanın düzenlenmesi, hücre döngüsü ve hücre ölümü gibi önemli mekanizmalarda kritik görevleri olduğu ve ifadeleri bozulan miRNA'ların kanser başta olmak üzere pek çok hastalık patolojisinde önemli rolleri olduğu son yıllarda yapılan birçok araştırmada belirtilmektedir. Bu durum, mikro RNA' ların hastalarda diagnostik ve prognostik biyo-belirteçler olarak kullanılmasını gündeme getirmiş ve hem temel araştırmalarda hem de klinikte mikro RNA belirlemeye yönelik teknikler geliştirilmesi yaygınlaşmıştır. Bu çalışmada, mevcut sistemlere alternatif oluşturubilecek sandviç hibridizasyona dayalı bir miRNA dizi platformunun geliştirilmesi üzerine çalışılmıştır. Sandviç hibridizasyon metot daha hızlı, daha hassas ve daha güvenilir tespit için geliştirilmiş birçok teknikten biridir. Bu metot, tespiti amaçlanan hedef mikro RNA ve buna yarı eşlenik olan iki oligonükleotid probdan oluşmaktadır.Bu sisteme göre hedef mikro RNA dizisinin bir kısmına eşlenik şekilde tasarlanmış olan yem prob (P1) cam yüzeye çapraz bağlayıcılar yardımıyla sabitlenmekte ve hedef mikroRNA'nın hibridizasyon yoluyla prob 1'e bağlanmasıyla birlikte adaptörün (hedef mikro RNA) varlığı yarı eşlenik olan sinyal probunun (P2) da sandviç sisteme bağlanması ile belirlenmektedir. Sandviç tabanlı mikro RNA dizi platformu RNA'nın direkt olarak kullanılmasına olanak sağlayarak, mevcut dizi sistemlerinde gerekli olan komplementer DNA sentezi ya da işaretlemeye gerek olmadan çalışabilmektedir. Sandviç hibridizasyon metotla platformun oluşturulabilmesi için poli-l lizin kaplı cam slaytlar kullanılmıştır. SM(PEG)n ve Sulfo-EMCS gibi farklı çapraz bağlayıcılar kullanılarak Prob 1 dizileri cam slayt yüzeyine tutturulmaya çalışılmıştır. Yem probu (Prob 1) yüzeye sabitleyecek çapraz bağlayıcı belirlendikten sonra bloklama koşullarını, sıcaklık, süre gibi hibridizasyon koşullarını, oligonükleotid tipini, probların konsantrasyonunu, washing koşullarını ve platformun hassasiyetini belirlemek amacıyla çeşitli parametler denenmiş ve optimizasyon deneyleri yapılmıştır.Bu deneyler ilk olarak miRNA 21 için denenmiş, neticesinde elde edilen sonuçlara göre en iyi sinyal 30 ⁰C'de, çapraz bağlayıcı olarak SM(PEG)2 kullanılarak, 0.1 μM platform hassasiyetinde, 20 μM P1 ve 20 μM P2 konsantrasyonunda elde edilmiştir. Daha sonra bu koşullar, sentetik miRNA dizileri ile çalıştırılmış ve koşullar miRNA prob setlerinin tümü için iyileştirilmiştir. Geliştirilen platformun hedeflenen diziye spesifik olup olmadığı bir çok sinyal probuyla karıştırılmış hedef mikro RNA'yı farklı yem probları içeren yüzeye uygulayarak test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre en iyi sinyal 45 ⁰C'de, çapraz bağlayıcı olarak SM(PEG)2 kullanılarak, 0.01 μM platform hassasiyetinde, 10 μM P1 ve 10 μM P2 konsantrasyonunda elde edilmiştir. Elde edilen koşullar ile platformun total RNA'lar ile çalışabilme potansiyeli farklı hücre hatlarından elde edilen total RNA örnekleri ile test edilmiş, normal ve kanserli hücrelerdeki mikro RNA ifadeleri ve platformda elde edilen sinyaller karşılaştırılmıştır. Daha sonra bu sinyallerle RT-PCR'dan elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, geliştirilen sistemin hedeflenen diziye spesiifik olduğu gözlemlenmiştir.
Özet (Çeviri)
MicroRNAs are small non-coding RNAs that are involved in important regulatory pathways such as differentiation, development, metabolism, cell proliferation, and cell death. Several recent research show that deregulated expression of miRNAs has crucial roles in disease pathologies, mainly in cancer. Therefore, it is likely that the usage of miRNAs as diagnostic and prognostic biomarkers in patients and the development of various techniques for the detection of microRNA in clinical research will become widespread. In this study, we aimed to develop an alternative to existing tools for the detection of miRNAs using an array platform based on sandwich hybridization. The sandwich hybridization method is one of the techniques developed for faster, more sensitive and reliable detection. This method constitutes target miRNA to be detected and two oligonucleotide probes which are half complementary to target miRNA. In this method, the capture probe (P1) which is fixed to the glass surface with the help of cross-linkers, is specific to one part of the target molecule.And then, target molecule binds to the capture probe and the existence of target molecule is defined with the binding of signal probe (P2). Sandwich hybridization system allows direct use of RNA and does not require any labelling or cDNA synthesis steps which are necessary in the current sequence systems. In order to construct platform with sandwich hybridization, glass slides coated with poly-l-lysin were used. The sequences of probe 1 were attached to the surface by using different cross linkers such as Sulfo-EMCS and SM(PEG)n. After the determination of cross linker which fixed probe 1 to surface, several parameters were tried to determine blocking conditions, hybridization conditions like temperature, duration, oligonucleotide type, signal probe, probes' concentration, washing conditions, and the sensitivity of platform and the optimization experiments were conducted. These experiments were conducted first for miR-21 and optimum hybridization signal was obtained with SM(PEG)2 as cross linker, 20 μM capture and 20 μM signal probe concentrations, and 0.1 μM platform sensitivity at 30 ⁰C. Then, these conditions were used for synthetic miRNA sequences and optimized for all miRNA probe sets. After these, the developed platform was tested whether it is unique for the targeted sequence or not by applying target sequence, mixed with several signal probes, to surface involving different capture probes.According to our results, optimum hybridization signal was obtained with 10 μM capture and 10 μM signal probe concentrations and 0.01 μM platform sensitivity at 45 ⁰C. The potential of platform workability with total RNAs obtained from different cell lines was tested. Finally, the comparison was made from the point of miRNA expression levels and signals between normal and cancer cells. Later, the obtained signals were compared with results taken from RT-PCR. The results indicated that the developed platform is specific enough to detect target miRNA sequences.
Benzer Tezler
- Development of a sandwich-type dna array platform for the detection of label-free oligonucleotide targets
İşaretsiz hedef oligonükleotidlerin tayini için sandviç tabanlı DNA dizi platformunun geliştirilmesi
SENA CANSIZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Bölümü
PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
YRD. DOÇ. DR. CAN ÖZEN
- 4-(triflorometoksi)fenoksi grupları içeren ftalosiyaninlerin sentezi, tıpta, biyolojide ve ileri teknolojide kullanılabilirliklerinin araştırılması
Synthesis of phthalocyanines containing 4- (trifluorometoxy) phenoxy groups and investigation of their usability in medicine, biology, and advanced technology
NAZLI FARAJZADEH
- Beyin hasarı biyobelirteçlerinin biyolojik numunelerden erken teşhisine yönelik analitik yöntem geliştirilmesi
Development of analytical methods for early diagnosis of brain injury biomarkers from biological samples
CEM ERKMEN
Doktora
Türkçe
2022
Eczacılık ve FarmakolojiAnkara ÜniversitesiAnalitik Kimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BENGİ USLU
DOÇ. DR. GÖZDE AYDOĞDU TIĞ
- Poli (metil metakrilat) tabanlı mikroçip kullanarak yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi ölçümüne dayalı luteinizan hormon tayini
Luteinizing hormone detection with poly (methyl methacrylate) microchip based on surface-enhanced Raman spectroscopy
BELMA GJERGJIZI
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NECDET SAĞLAM
- Generation of aptamer against Salmonella serovar enteritidis and development of aptamer-based capillary biosensor
Salmonella enteritidis'e karşı aptamer seçimi ve aptamer tabanlı kapiler biyosensorün geliştirilmesi
CEREN BAYRAÇ
Doktora
İngilizce
2014
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
PROF. DR. FÜSUN EYİDOĞAN