Geri Dön

Development of sandwich type nucleic acid array platform for the detection of microRNAs in breast cancer

Meme kanseri tespiti için sandviç tabanlı nükleik asit dizi platformunun geliştirilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 385112
  2. Yazar: SEREN ATILGAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Bilim ve Teknoloji, Biyoteknoloji, Biology, Science and Technology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2014
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

MikroRNA'ların gelişim ve farklılaşma yolakları, metabolizmanın düzenlenmesi, hücre döngüsü ve hücre ölümü gibi önemli mekanizmalarda kritik görevleri olduğu ve ifadeleri bozulan miRNA'ların kanser başta olmak üzere pek çok hastalık patolojisinde önemli rolleri olduğu son yıllarda yapılan birçok araştırmada belirtilmektedir. Bu durum, mikro RNA' ların hastalarda diagnostik ve prognostik biyo-belirteçler olarak kullanılmasını gündeme getirmiş ve hem temel araştırmalarda hem de klinikte mikro RNA belirlemeye yönelik teknikler geliştirilmesi yaygınlaşmıştır. Bu çalışmada, mevcut sistemlere alternatif oluşturubilecek sandviç hibridizasyona dayalı bir miRNA dizi platformunun geliştirilmesi üzerine çalışılmıştır. Sandviç hibridizasyon metot daha hızlı, daha hassas ve daha güvenilir tespit için geliştirilmiş birçok teknikten biridir. Bu metot, tespiti amaçlanan hedef mikro RNA ve buna yarı eşlenik olan iki oligonükleotid probdan oluşmaktadır.Bu sisteme göre hedef mikro RNA dizisinin bir kısmına eşlenik şekilde tasarlanmış olan yem prob (P1) cam yüzeye çapraz bağlayıcılar yardımıyla sabitlenmekte ve hedef mikroRNA'nın hibridizasyon yoluyla prob 1'e bağlanmasıyla birlikte adaptörün (hedef mikro RNA) varlığı yarı eşlenik olan sinyal probunun (P2) da sandviç sisteme bağlanması ile belirlenmektedir. Sandviç tabanlı mikro RNA dizi platformu RNA'nın direkt olarak kullanılmasına olanak sağlayarak, mevcut dizi sistemlerinde gerekli olan komplementer DNA sentezi ya da işaretlemeye gerek olmadan çalışabilmektedir. Sandviç hibridizasyon metotla platformun oluşturulabilmesi için poli-l lizin kaplı cam slaytlar kullanılmıştır. SM(PEG)n ve Sulfo-EMCS gibi farklı çapraz bağlayıcılar kullanılarak Prob 1 dizileri cam slayt yüzeyine tutturulmaya çalışılmıştır. Yem probu (Prob 1) yüzeye sabitleyecek çapraz bağlayıcı belirlendikten sonra bloklama koşullarını, sıcaklık, süre gibi hibridizasyon koşullarını, oligonükleotid tipini, probların konsantrasyonunu, washing koşullarını ve platformun hassasiyetini belirlemek amacıyla çeşitli parametler denenmiş ve optimizasyon deneyleri yapılmıştır.Bu deneyler ilk olarak miRNA 21 için denenmiş, neticesinde elde edilen sonuçlara göre en iyi sinyal 30 ⁰C'de, çapraz bağlayıcı olarak SM(PEG)2 kullanılarak, 0.1 μM platform hassasiyetinde, 20 μM P1 ve 20 μM P2 konsantrasyonunda elde edilmiştir. Daha sonra bu koşullar, sentetik miRNA dizileri ile çalıştırılmış ve koşullar miRNA prob setlerinin tümü için iyileştirilmiştir. Geliştirilen platformun hedeflenen diziye spesifik olup olmadığı bir çok sinyal probuyla karıştırılmış hedef mikro RNA'yı farklı yem probları içeren yüzeye uygulayarak test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre en iyi sinyal 45 ⁰C'de, çapraz bağlayıcı olarak SM(PEG)2 kullanılarak, 0.01 μM platform hassasiyetinde, 10 μM P1 ve 10 μM P2 konsantrasyonunda elde edilmiştir. Elde edilen koşullar ile platformun total RNA'lar ile çalışabilme potansiyeli farklı hücre hatlarından elde edilen total RNA örnekleri ile test edilmiş, normal ve kanserli hücrelerdeki mikro RNA ifadeleri ve platformda elde edilen sinyaller karşılaştırılmıştır. Daha sonra bu sinyallerle RT-PCR'dan elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, geliştirilen sistemin hedeflenen diziye spesiifik olduğu gözlemlenmiştir.

Özet (Çeviri)

MicroRNAs are small non-coding RNAs that are involved in important regulatory pathways such as differentiation, development, metabolism, cell proliferation, and cell death. Several recent research show that deregulated expression of miRNAs has crucial roles in disease pathologies, mainly in cancer. Therefore, it is likely that the usage of miRNAs as diagnostic and prognostic biomarkers in patients and the development of various techniques for the detection of microRNA in clinical research will become widespread. In this study, we aimed to develop an alternative to existing tools for the detection of miRNAs using an array platform based on sandwich hybridization. The sandwich hybridization method is one of the techniques developed for faster, more sensitive and reliable detection. This method constitutes target miRNA to be detected and two oligonucleotide probes which are half complementary to target miRNA. In this method, the capture probe (P1) which is fixed to the glass surface with the help of cross-linkers, is specific to one part of the target molecule.And then, target molecule binds to the capture probe and the existence of target molecule is defined with the binding of signal probe (P2). Sandwich hybridization system allows direct use of RNA and does not require any labelling or cDNA synthesis steps which are necessary in the current sequence systems. In order to construct platform with sandwich hybridization, glass slides coated with poly-l-lysin were used. The sequences of probe 1 were attached to the surface by using different cross linkers such as Sulfo-EMCS and SM(PEG)n. After the determination of cross linker which fixed probe 1 to surface, several parameters were tried to determine blocking conditions, hybridization conditions like temperature, duration, oligonucleotide type, signal probe, probes' concentration, washing conditions, and the sensitivity of platform and the optimization experiments were conducted. These experiments were conducted first for miR-21 and optimum hybridization signal was obtained with SM(PEG)2 as cross linker, 20 μM capture and 20 μM signal probe concentrations, and 0.1 μM platform sensitivity at 30 ⁰C. Then, these conditions were used for synthetic miRNA sequences and optimized for all miRNA probe sets. After these, the developed platform was tested whether it is unique for the targeted sequence or not by applying target sequence, mixed with several signal probes, to surface involving different capture probes.According to our results, optimum hybridization signal was obtained with 10 μM capture and 10 μM signal probe concentrations and 0.01 μM platform sensitivity at 45 ⁰C. The potential of platform workability with total RNAs obtained from different cell lines was tested. Finally, the comparison was made from the point of miRNA expression levels and signals between normal and cancer cells. Later, the obtained signals were compared with results taken from RT-PCR. The results indicated that the developed platform is specific enough to detect target miRNA sequences.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    286084

    Development of a sandwich-type dna array platform for the detection of label-free oligonucleotide targets

    İşaretsiz hedef oligonükleotidlerin tayini için sandviç tabanlı DNA dizi platformunun geliştirilmesi

    SENA CANSIZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Bölümü

    PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

    YRD. DOÇ. DR. CAN ÖZEN

  2. Tez No

    286091

    Development of an oligonucleotide based sandwich array platform for the detection of transgenic elements from plant sources using label-free PCR products

    İşaretlenmemiş PZR ürünlerini kullanarak bitkilerden transgenik elementlerin tespiti için oligonukleotit tabanlı sandviç dizi platformunun geliştirilmesi

    FATMA GÜL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Bölümü

    DOÇ. DR. FÜSUN İNCİ EYİDOĞAN

    PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

  3. Tez No

    981974

    Farklı hücre geometrilerine sahip 3D spacer dokuma sandviç kompozitler geliştirilmesi

    Development of 3D spacer woven sandwich composites with different cell geometries

    AHMET GÖKHAN ÖZDEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    Tekstil ve Tekstil MühendisliğiKahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi

    Tekstil Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GAYE KAYA

  4. Tez No

    1014032

    Kayma altında katılaşan sıvı takviyeli poliüretan dolgulu sandviç kompozit geliştirilmesi ve mekanik özelliklerinin incelenmesi

    Development of shear thickening fluid reinforced polyurethane filled sandwich composite and investigation of its mechanical properties

    BETÜL SÖZEN COŞKUN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2026

    Makine MühendisliğiKonya Teknik Üniversitesi

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖMER SİNAN ŞAHİN

  5. Tez No

    305161

    Development of high fill factor and high performance uncooled infrared detector pixels

    Yüksek etkin alanlı ve yüksek performanslı soğutmasız kızılötesi detektörlerinin geliştirilmesi

    ŞENİZ ESRA KÜÇÜK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Elektrik ve Elektronik MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Elektrik ve Elektronik Mühendisliği Bölümü

    PROF. DR. TAYFUN AKIN

Geri Dön