Geri Dön

Qualitative and quantitative analysis of Helicobacter pylori analytes in sera of infected subjects

Helicobakter pylori enfekte hastaların serumlarındaki analitlerin kantitatif ve kalitatif analizleri

PDF İndir

  1. Tez No: 409054
  2. Yazar: DUYGU YAZICI
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. BARİK SALİH
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Mikrobiyoloji, Biology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Fatih Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 74

Özet

Başta gelişmekte olan ülkeler olmak üzere dünya popülasyonunun yarısından fazlası Helicobacter pilori tarafından enfekte edilmiştir. Bunlar arasından milyonlarca insan hayatları süresince peptik ülser hastalığını geliştirebilir ve birçok insanda ise mide kanseri baş gösterebilir. CagA (cytotoxin-associated gene) geni tarafından kodlanan cagA proteininin H. pilori tarafından üretilen önemli bir virulans faktör olduğu düşünülmektedir. cagA geninin durumu sadece, biyopsi toplamında invazif metot (endoskopi) kullanımı gerektiren moleküler teknikler (PCR) ile belirlenebilir. Ayrıca serumdaki anti-cagA antikorlarını ELISA testi ile tespit ederek dolaylı olarak da genin durumuna bakılabilir. Amacımız 2 farklı ELISA testi geliştirerek enfekte olmuş kişilerin kanlarındaki H. pylori antikorlarının tespit etmek (kalitatif analiz); kendi ürettiğimiz rekombinant CagA (rCagA) proteinini kullanarak dolaylı ELISA testi geliştirmek ve hasta serumundaki anti-CagA antikorları ile rekabet oluşturup daha önce üretilen monoklonal antikorun (Mab) bağlanma kapasitesini ölçmek için kendi kompetitif ELISA testimizi geliştirmektir. Ayrıca hasta serumlarında CagA proteini olup olmadığının tesbiti için yakalama ELISA testinin geliştirilmesidir (kantitatif analiz). Doksan bir peptic ülser hastası bu çalışmaya dahil olmuştur ve bu astalardan 59'u H. pilori pozitiftir. Bu pozitif hastalardan 36 tanesinin PCR ile cagA pozitif olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca cagA pozitif olan 27 örnek dolaylı ELISA testinde de pozitif sonuç vermiştir. Biz bu test üzerinde çalışırken piyasaya ticari bir ELISA testi sunulmuştur. Kendi dolaylı ELISA testimizde kullanılan serumlar ile aynı serumlar kullanılmıştır ve alınan değerler kendi dolaylı ELISA testimiz ile karşılaştırılmıştır. Alınan istatistik sonuçlara göre kendi dolaylı testimizin duyarlılık, spesifiklik, pozitif tahmini değer ve negative tahmini değer sonuçları şöyledir; %75, %91.30, %81.30, %89.61 ve %79.90. Ve ticari test için aynı sonuçlar şöyledir; %80.56, %91.30, %84.70 %90.25 ve %82.45. ROC eğrisi analizinden alınan sonuçlara göre kendi dolaylı testimiz ve ticari test arasında yakın benzerlik vardır ve grafiklerin altında kalan alan kendi dolaylı testimiz için 0.81 ve ticari ELISA testi için 0.83'dür. Kompetitif ELISA için yüzde inhibisyon değerleri bulunmuştur. Bu değerler kullanılan Mab'ın serumdaki anti-CagA antikorlarının bağlanmasını ne kadar inhibe ettiğini göstermektedir. Bu testte 4'ü yüksek pozitif OD değerine sahip 22 pozitif serum vardır ve bu demek oluyor ki hastanın kanındaki anti-CagA antikorların kendi Mab'ımız ile rekabete girebilmektedir. Ayrıca bu sonuçlar kendi Mab'ımızın bağlandığı epitopun rCagA proteininde dominant antijenik etken olduğunu göstermektedir. Geliştirmiş olduğumuz yakalama ELISA testi tercihen antikorlardan ziyade CagA proteininin kendisini saptamak için yapıldı. Bunu ilk defa yaptımızdan dolayı ilk olarak anti-CagA antikorlarının tespiti için geliştirilen kendi dolaylı ELISA testimizden elde ettiğimiz sonuçlar kullanıldı ve bu H. pilori bakterisinin antikor üretiminin uyarılmasını sağlayan CagA proteinini salgıladığının kanıtıdır. Daha sonra testin testin iyi bir şekilde çalıştığından emin olmak için kendi rCagA proteinimizi bu testte bilinmeyen olarak kullandık ve düşük konsantrasyonda antijen varlığını tespit edebildik. Ama hasta serumlarını test ettiğimiz zaman CagA antijeni tespit edilmedi. Bu hasta serumunda düşük konsatrasyonda antijen olduğunun ya da hiç antijen olmadığının göstergesidir. Sonuç olarak bu çalışma kendi dolaylı ELISA testimizin ticari olarak bulunan kitlere benzer olarak anti-CagA antikorlarının tespitinde kullanılabileceğini gösterdi ve ayrıca kendi rCagA proteinimizin bu tez için uygun olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, kendi kompetitif ELISA testimizden elde edilen sonuçlar hasta serumundaki anti-CagA antikorlarının kendi Mab'ımız ile aynı epitopa bağlanabilmek için rekabete girebildiğiniz gösterdi. Ayrıca kendi rCagA proteinimizin üzerinde bulunan epitop bakteriyel CagA proteini üzerindeki epitopu taklit ettiğini gösterdi ve güçlü antikor cevabını tetikleten immünodominant bir antijen olduğunu gösterdi. Kendi geliştirdiğimiz ELISA testimize göre serum örneklerinde CagA antijeni tespit edilmemesine rağmen bu test gelecekte gayta örneklerinde bulunan H. pilori antijenlerinin tespiti için potansiyele sahiptir.

Özet (Çeviri)

Over half of the world populations are infected with Helicobacter pylori among those, millions of subjects develop peptic ulceration that might also progress to gastric cancer. The genotypic diversity among H. pylori strains affects the clinical outcome where certain strains can cause more severe diseases than others. The CagA protein encoded by the cytotoxin-associated gene (cagA) is considered to be one of the key virulence factors of H. pylori. Unfortunately the cagA gene status can only be determined by PCR that requires gastric biopsy collection by endoscopy (invasive method). Serology is an alternative non-invasive approach for the detection of H. pylori infection where antibodies can be detected by the ELISA test. However, commercially available ELISA tests detect antibodies to whole H. pylori antigens but not specifically the anti-CagA antibodies. Up to the development of this test in our laboratory, no commercial ELISA test for the detection of anti-CagA antibodies were available. Our aims are to detect anti-cagA antibodies of H. pylori in sera of infected subjects by the development of 2 different ELISA tests (qualitative analysis): an in-house indirect ELISA test using our own developed recombinant CagA protein (rCagA) and an in-house competitive ELISA for determination of the binding capacity of our own produced monoclonal antibody (Mab) through competition with anti-CagA antibodies in patients sera. In addition, to develop our own in-house capture ELISA using our Mab in an attempt to detect the CagA protein in the patients' sera (quantitative analysis). Ninety one patients attended our Fatih University hospital were enrolled in this study, of these 59 were H. pylori positive and among these 36 were cagA positive as detected by PCR. For the indirect ELISA the test was positive in 27 samples that were also cagA positive by PCR. By the time we developed our test a commercial indirect ELISA kit became available in the market. We tested the same sera with the commercial kit and then compared the results with those obtained by our ELISA test. Statistical analysis of the data showed that the sensitivity, specificity, accuracy, positive predictive values and negative predictive values of our indirect ELISA were 75%, 91.30%, 81.30%, 89.61% and 79.50% respectively and those of the commercial ELISA were 80.56%, 91.30%, 84.70%, 90.25% and 82.45% respectively. The ROC curve analysis showed an area under the curve of a close similarity between our indirect ELISA and the commercial ELISA of 0.81 and 0.83 respectively. No significant differences were found between the two tests. For the competitive ELISA, percent inhibition (PI) value represents how much the Mab inhibits the binding of anti-CagA antibodies present in the sera. In this test, among 22 positive sera 4 were with high OD gave high PI values indicating a competition event in which the anti-CagA antibodies in patients sera competed with our Mab. This suggests that the epitope recognized by our Mab is one of the dominant antigenic determinants on our rCagA protein. The capture ELISA test we developed was an attempt to detect the CagA antigen itself rather than the antibodies. To do this and since this is a first attempt, we first used the results obtained in our own indirect ELISA in which anti-CagA antibodies was detected so this was an approval that H. pylori secretes CagA protein that stimulate antibody production. Next we used our rCagA protein as an unknown in this test to make sure that the test set up works well and we were able to detect the antigen at very low concentration. However when we tested our patients sera no CagA antigen was detected. This might be attributed to the low concentration or the absence of such antigen in patients sera. In conclusion, this study showed that our in-house indirect ELISA can be used in the detection of anti-CagA antibodies similar to the commercially available kit and also emphasized that our rCagA is suitable for this test. In addition, the results obtained by our competitive ELISA provided an important information where it first showed that antibodies in the patients sera competed with our Mab for binding to the same epitope, it also showed that the epitope present on our rCagA protein mimics the one present on the bacterial CagA protein and it showed that it is an immunodominant antigen that triggered a strong antibody response. In regards to our developed capture ELISA test although no CagA antigen was detected in serum samples the test set up has the potential to be used for the detection of H. pylori antigen in stool samples in the future.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    493360

    Mide adenokarsinom tanılı olgularda immunohistokimyasal olarak saptanan cerbb2'nin mrna düzeyinde araştırılması ve klinikopatolojik prognostik belirteçlerle olan ilişkisi

    The mrna expression analysis of cerbb2 in gastric adenocarcinoma and its correlation with clinicopathological prognostic parameters

    EZGİ IŞIL TURHAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    PatolojiUludağ Üniversitesi

    Patoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BERNA AYTAÇ VURUŞKAN

  2. Tez No

    492763

    Mide kanserinde polimorfik Helicobacter Pylori CagA genotiplerinde miR-200a-3p, miR-223-5p ve miR-29a-3p ekspresyon analizi

    Expression Analysis of miR-200a-3p, miR-223-5p and miR-29a-3p in Polymorphic Helicobacter Pylori CagA Genotypes in Gastric Cancer

    MEYREM OSUM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    GenetikHaliç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MELİHA BURCU IRMAK YAZICIOĞLU

  3. Tez No

    518105

    Investigation of the relation between Helicobacter pylori and T cell response with examination of PD-L1 expression level in gastric pathogenesis

    Mide patogenezinde PD-L1 ekspresyon seviyesinin belirlenmesi ile Helikobakter pylori ve T hücre cevabıyla arasındaki ilişkinin araştırılması

    ELİF MERVE AYDIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  4. Tez No

    492759

    Mide kanserinde polimorfik Helicobacter pylori vaca genotiplerinde miR-200a-3p, miR-223-5p AND miR-29a-3P miRNA'larının ekspresyon analizi

    Expression analysis of miR-200a-3p, miR-223-5p AND miR-29a-3P miRNA in polymorphic Helicobacter pylorium vaca genotypes in gastric cancer

    FERHAT ERDOĞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    GenetikHaliç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MELİHA BURCU IRMAK YAZICIOĞLU

  5. Tez No

    478373

    Helicobacter pylorinin (HP) eradikasyonunda kullanılan klaritromisin, amoksisilin ve lansoprazol etken maddelerinin eş zamanlı spektrofotometrik olarak tayini

    Designation of active ingredients of clarithromycin, amoxicillin and lansoprazole that are used for the eradication of Helicobacter pylori (HP) by simultaneous and spectrophotometric determination

    KAZIM BAĞRIAÇIK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    KimyaSüleyman Demirel Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. GÜZİDE ERTOKUŞ

Geri Dön