Geri Dön

Alfa-Amilaz, üreten bazı bacıllus suşlarının gelişme parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu

Optimization of growth parameters, enzyme characteristics and production conditions of some alpha-amylase producing bacillus strains

  1. Tez No: 45733
  2. Yazar: ELİF SARIKAYA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. VELİTTİN GÜRGÜN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 1995
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ankara Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 130

Özet

ÖZET Doktora Tezi ALFA-AMİLAZ ÜRETEN BAZI BACILLUS SUŞLARININ GELİŞME PARAMETRELERİ, ENZİM ÖZELLİK VE ÜRETİM KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU1 ELİF SARIKAYA Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof.Dr.Velittin GÜRGÜN 1995, Sayfa: 114 Jüri: Prof.Dr.Velittin GÜRGÜN Prof.Dr.Nezihe TUNAİL Doç.Dr.Nuran DİRİL Bu çalışmada a -amilaz enzimi üreten bir firma (ORBA Biyokimya, İstanbul'dan sağlanan 2 adet Bacillus subtüis ve 2 adet Bacillus amyloliquefaciens ile A.Ü.Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümünden temin edilen 2 adet Bacillus subtilis suşlarının aktivite tayinleri yapılmış ve firma'dan sağlanan 1 adet B. subtilis ve 2 adet B. amyloliquefaciens (Çalışmada 1 ve 2 numara ile adlandırıldı) suşlarının diğer suşlara oranla daha yüksek a-amilaz enzim aktivitesi gösterdikleri saptandığından, bu bakterilerin enzim üretimlerini arttırıcı koşullar ile elde edilen enzimlerin özellikleri üzerinde çalışılmıştır. Çalışmada firmanın şu an enzim üretiminde kullandığı besiyeri ve bir referans besiyeri (Bezbaruah et al 1991) ile her iki besiyerinin modifikasyonu ile elde edilen bir başka besiyeri denenmiş olup, yapılan aktivite ölçümlerinde modifiye besiyerinde diğer besiyerlerine oranla daha yüksek enzim aktivitesi sağlandığından çalışmalara bu besiyeri ile devam edilmiştir. Her üç Bacillus susunun 88 saatlik üretimleri sonucunda 72. saatte maksimum seviyede enzim ürettikleri saptanmıştır. Modifiye besiyerinin içeriğinde bulunan karbon ve azot kaynakları, metal iyonları ve ortamdaki çözünmüş oksijen miktarları değiştirilmek suretiyle enzim üretimini arttırmak yoluna gidilmiştir. Bu amaçla farklı karbon kaynaklan kullanıldığında B. subtilis'in sodyumsitrat, B. amyloliquefaciens 1 susunun nişasta ve B. amyloliquefaciens 2 susunun ise sakkaroz varlığında diğer karbon kaynaklarına göre daha yüksek oranda enzim ürettikleri tespit edilmiştir. Ayrıca bu denemeler sonucunda bütün çalışmalarda mukoz oluşumu gösteren B. subtilis'in sodyumsitrat valıgında hiç mukoz oluşturmadığı da saptanmıştır. Azot kaynaklarının etkisi araştırıldığında, B. subtilis ve B. amyloliquefaciens 2 suşlarının inorganik azot kaynağı olarak kullanılan amonyum sülfat varlığında, B. amyloliquefaciens 1 susunun ise organik azot kaynağı olarak kullanılan maya ekstraktı varlığında maksimum seviyede enzim ürettikleri belirlenmiştir. Her üç Bacillus susunda enzim üretimi üzerine farklı metal iyonları kombinasyonları denendiğinde enzim veriminde bir artış elde edilememiştir. Bacillus türlerinin üretim koşullarında önemli bir faktör olan çözünmüş oksijen konsantrasyonunun arttırılmasının a-amilaz üretiminde oldukça önemli bir yükselmeye neden olduğu saptanmıştır. Üretim koşullarının değiştirilmesi ile enzim verimini arttırıcı yolların denemesi yanında, son yıllarda ekstraselüler enzimlerin fermentasyon ortamından ayrılmasında kullanılan sulu iki-faz sistemlerinin amilaz enziminin elde edilmesinde de kullanılabilirliği araştırıldığında, sistemin a- amilaz enzim üretiminde çok elverişli olmadığı sonucuna varılmıştır. Diğer yandan, enzimin hücre içerisinde kalma olasılığı dikkate alındığında, fermentasyon sonunda bu kalan enzimin de hücredensalınmasını kolaylaştırmak için denenen stres faktörlerinin enzim verimini arttırmadığı, tam tersine büyük ölçüde düşürdükleri saptanmıştır. Bakteri sporlanması ve Bacillus'larda diğer önemli bir ekstrasellüler enzim olan proteazlar ile a -amilaz enzim üretimi arasında bir ilişki olup olmadığı araştırılmış ve her iki unsurun a-amilaz üretimi üzerine etkili olmadıkları sonucuna varılmıştır. Her üç Bacillus susundan elde edilen a-amilaz enzimlerinin özellikleri araştırıldığında, her üç enzimin de 55°C'de optimum aktivite gösterdikleri ve yapılan sıcaklık stabilite denemelerinde enzimlerin 1 saate kadar az da olsa aktifliğini devam ettirdikleri ancak, termostabil olarak değerlendirilmelerinin mümkün olmadığı da belirlenmiştir. pH'nın enzim aktivitesi üzerine etkileri araştırıldığında optimum pH'nm B. subtilis a-amilazı için 7.0, B. amyloliquefaciens 1 ve 2 suşlarmdan elde edilen a-amilaz enzimi için ise 5.9 olduğu bulunmuş olup, bu enzimlerin pH stabiliteleri araştırıldığında her üç enzimin alkali koşullarda asidik koşullara oranla daha az aktivite kaybettikleri ve alkali taraftaki aktivitenin 24 saat süre ile az da olsa korunabildiği tespit edilmiştir. a-amilaz enzim aktivitesi metal iyonlarına bağlı olduğundan, farklı metal iyonları kullanılarak bunların enzim aktivitesi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Her üç Bacillus susunun da 5 mM metal iyonları varlığımda fazla bir aktivite artışı göstermemelerine rağmen, göreceli olarak bir değerlendirme yapıldığında Ca++, Mg++ ve Li++'un her üç bakteri enziminde, Ba++,un ise sadece B. subtilis a-amilaz enzimi üzerinde stimulator etki yaptıkları, buna karşın Ag+, Zn+ + ve Cu+ +,m ise inhibe edici rol oynadıkları belirlenmiştir. Fe+ +'in ise sadece B. subtilis' 'den elde edilen enzimin aktivitesinde çok düşük bir azalmaya neden olduğu, diğer suşlardan elde edilen enzimlerde ise diğer inhibe edici metal iyonları gibi çok önemli bir aktivite kaybına yol açtığı saptanmıştır. Enzimin substrat parçalanma ürünlerini belirlemek üzere yapılan ince tabaka kromatografisi sonuçlarına göre her üç Bacillus'dan elde edilen enzimlerin nişastayı az miktarda glukoza, büyük miktarda da başta maltoz olmak üzere maltooligosakkaritlere ayrıştırdığı tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarda en yüksek enzim aktivitesine sahip bir suş olarak belirlenen B. amyloliquefaciens 2'den elde edilen enzim çeşitli basamaklarda saflaştırılıp, karakterize edilmiştir. Enzim % 80 amonyum sülfat çöktürmesinden sonra diyalize edilmiş ve sephadex G-75 jel filtrasyomı ile ileri bir saflaştırma aşaması uygulandığında başlangıca göre 17.6 kez saflaştırılabilmiş, buna karşın enzim verimi % 15.8'e düşmüştür. Saflaştırılan enzim ile Sigma'dan sağlanan ticari toz enzimin (A1278) molekül ağırlıklarını belirlemek üzere yapılan çalışmalarda ise her iki enzimin de yaklaşık 47000 dalton'Iuk bir molekül ağırlığa sahip olduğu belirlenmiştir. Her iki enzim üzerine sıcaklık, pH ve metal iyonlarının etkilerine bakıldığında saflaştırılan enzimin 55°C'deki sıcaklık ve pH: 6.0'da ticari enzimin ise 50°C'deki sıcaklık ve pH: 5.4'de optimum aktivite gösterdikleri ve saflaştırılan enzimin yüksek sıcaklık ile düşük ve yüksek pH'da stabil olmadığı saptanmıştır. Metal iyonlarından Ca+ + ve Mgf 4 'un enzim üzerinde az da olsa stimulator rol oynadığı, buna karşın ticari enzimin hiçbir metal iyonu varlığında olumlu yönde etkilenmediği belirlenmiştir. ANAHTAR KELİM ELER: a -amilaz, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, enzim üretimi, sulu iki- faz sistemi, ince tabaka kromatografisi, enzim özellikleri 1J Bu araştırma, Ankara Üniversitesi Araştırma Fonunca Desteklenmiştir.

Özet (Çeviri)

m ABSTRACT Ph.D. Thesis OPTIMIZATION OF GROWTH PARAMETERS, ENZYM CHARACTERISTICS AND PRODUCTION CONDITIONS OF SOME ALPHA-AMYLASE PRODUCING BACILLUS STRAINS2 Elif SARIKAYA Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof.Dr.Velittin GÜRGÜN 1995, Page: 114 Jury: Prof.Dr.Velittin GÜRGÜN Prof.Dr.Nezihe TUNAİL Assoc.Prof.Dr.Nuran DİRİL In this study as a research material two Bacillus subtilis and two Bacillus amyloliquefaciens strains, obtained from ORBA-Biochemicals Istanbul (an a -amylase producing plant) and two B. subtilis strains, obtained from the Department of Food Engineering, Faculty of Agriculture of the University of Ankara were used. One of the B. subtilis and both B. amyloliquefaciens strains of ORBA were showed much higher enzyme activity than others. They were used for further investigations releated the improvement of media to increase the enzyme yield and to characterize the enzyme obtained from these strains. Three kinds of media with a different content (ORBA, Bezbaruah et al (1991), and modified medium) were tested for their acceptability for enzyme production of each strain. The modified medium was the most convinient medium to obtain higher enzyme activity and therefore it was choosen as a standard medium for further investigations for all strains. The enzyme production experiments by all strains were followed up to 88lh hours, but it was found out that they produced «-amylase on maximum level at 72lh hours. In order to increase the enzyme productivity, the formulation of modified medium was changed on it's carbon, nitrogen and mineral element contents and dissolved oxygen concentration. The results releted to carbon sources were showed, that all strains could produce more enzyme with different kind of carbon source i.e. B. subtilis with Na-citrate, B. amyloliquefaciens 1 with soluble starch and B. amyloliquefaciens 2 with sucrose. Additionally, B. subtilis wasn't produced any mucous material during it's incubation period with Na-citrate as sole carbon source, while that was the bigest problem, if other carbon sources were used. On the other hand, B. subtilis and B. amyloliquefaciens 2 strains were desired to produce more enzyme with ammonium sulphate as nitrogen source, while B. amyloliquefaciens 1 was prefered yeast extract for this purpose. None of the additional metal ions were increased the enzyme activity by all strains, while a slight increasing were obtained by increased oxygen concentration. In order to separate the a-amylase from the rest of the culture media, a method based on aqueous two-phase system was investigated. All modifications of phase side were showed that, this method was not suitable for a-amylase production. Though a-amylase is a secreting enzyme, some stress factors like temparature, pH and oxygen-tension and their combinations were applied on cell cultures after growing them for 72 hours. None of them were caused to increase the enyzme activity, on the contrary less activity were measured.IV The enzyme activity of all strains were not affected by the sporulation of bacteria and their protease activity. The optimum enzyme activity of all enzymes were obtained from representative strains by 55°C, but the heat stability tests up to 90°C showed that none of them were stabile. While the optimum pH of B. subtilis was 7.0, both strains of B. amyloliquefaciens were reached their maximum for enzyme activity at pH 5.9. They were more stabile on the alkaline side than acidic side and they were still active for 24 hours after they were treated with alkaline. Since a -amylase activity is depended on metal ions, various metal ions for their effects on the enzyme activity were tested. Though an appearent stimulatory effect of any metal ions were not detected, a 5 mM concentration of Ca++, Mg++ and Li++ on all enzymes obtained from three strains and Ba++ on B. subtilis strain were observed, while an inhibitory effect of Ag+, Zn++ and Cu+ + were apparently obtained. Fe+ +, on the other hand, had a very little effect of B. subtilis enzyme, but inhibited as much as other elements by other strains. The split products of starch by a -amylase, obtained from all strains were determined by thin-layer chromatography. The main product was maltose within maltooligosaccharides and a little amount of glucose was also determined. The a -amylase, obtained from B. amyloliquefaciens 2, which showed the highest activity between three strains, was purified and characterized. After the purifications steps of ammonium sulphate (% 80) precipitation, dialization and gel filtration (Sephadex G-75), the enzyme was purified 17.6 fold, but the yield of enzyme was decreased up to 15.8 % compared with crude enzyme. The molecular weight of enzyme was compared with a Sigma a-amylase (A1278) and found out that they were identical with a 47000 daltons. The effect of temperature, pH and metal ions on purified and commercial enzyme were quite different. The optimum temperature and pH values of purified and commercial enzyme activities were 55°C, 6.0 pH and Sff'C, 5.4 pH, respectively. The purified enzyme was not stabile at elevated temperature and at low or high pH values. Some metal ions such as Ca+ + and Mg+ + were stimulated a little on the purified enzyme activity, while commercial enzyme was not affected at all. KEYWORDS: a-amylase, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, enzyme production, aqueous two-phase system, Thin layer chromatography, enzyme characteristics. 2) This Research was supported by The Research Found of Ankara University.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    594265

    Termal kaynaklardan sıcaklığa dirençli alfa-amilaz enzimi üreten bakteri izolasyonu ve enzimin kısmi karakterizasyonu

    Isolation of thermostable alpha-amylase producing bacterium from thermal springs and partial characterization of the enzyme

    GÜLTEKİN ÖZDEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyoteknolojiOsmaniye Korkut Ata Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BAHRİ DEVRİM ÖZCAN

  2. Tez No

    382724

    Isolation, partial purification and characterization of alpha amylase produced by streptomyces sp

    Streptomyces sp tarafından üretilen alfa amilazın izolasyonu, kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu

    AYŞEGÜL ÇALIŞKAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyolojiFatih Üniversitesi

    Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. FAHRİ AKBAŞ

  3. Tez No

    199936

    Yöresel bir gıdadan izole edilen bakteriyosin üreten bakterinin teşhisi ve bakteriyosinin karakterizasyonu

    Identification of a bacteriocin producing bacterium isolated from a traditional product and characterization of its bacteriocin

    DİDEM ASUTAY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    Gıda MühendisliğiGaziosmanpaşa Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. ZELİHA YILDIRIM

  4. Tez No

    382760

    Isolation and identification of soil bacteria capable of producing alpha-amylase

    Alfa amılaz üretebılen toprak bakterısının ızolasyonu ve sınıflandırılması

    SALIHU YAHUZA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyomühendislikFatih Üniversitesi

    Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. FAHRİ AKBAŞ

  5. Tez No

    233807

    Türkiye'nin değişik bölgelerinden termostabil alfa amilaz üreten Bacillus sp. türlerinin izolasyonu karakterizasyonu ve alfa amilaz geninin klonlanması

    Isolation and characterization of ? -amylase producing Bacillus sp. isolated from different areas of Turkey and cloning of ? -amylase gene

    TUĞBA ŞİMŞEK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ÖZLEM OSMANAĞAOĞLU

Geri Dön