Cloning and expression of periplasmic (CLpP-LIKE) and memrane-bound serine protease genes of thermoplasma volcanium in escherichia coli
Thermoplasma volcaniumun periplazmik (CLpP-benzeri) ve membrana-bağlı serin proteaz enzim genlerinin escherichia colide klonlanması ve anlatımı
- Tez No: 172239
- Danışmanlar: PROF.DR. SEMRA KOCABIYIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Serin proteaz, Thermoplasma volcanium, Klonlama, Anlatım. Vll, Serine protease, Thermoplasma volcanium, Cloning, Expression
- Yıl: 2006
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 170
Özet
ÖZ THERMOPLASMA VOLCANIUMVN PERİPLAZMÎK (CLP P-BENZERİ) ve MEMBRANA-BAĞLI SERİN PROTEAZ ENZİM GENLERİNİN ESCHERICHIA COLFDE KLONLANMASI VE ANLATIMI DEMİROK, Burçak Yüksek Lisans, Biyolojik Bilimler Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Semra KOCABIYIK Ocak 2006, 149 sayfa Serin proteazlar, peptid bağlarının katalitik hidrolizini gerçekleştirmek için substrat bağlanma bölgesindeki aktif serin grubunu kullanan bir proteaz ailesidir. Bu aileye üye, farklı metabolik ve düzenleyici fonksiyonlara sahip enzimler, hücre fizyolojisi ve patolojisinde kritik rol oynarlar. Bir proteaz (ClpP) ve bir ATPaz (ClpA veya ClpX) bileşeninden oluşan 'Cip' ler, ATP bağımlı serin proteazların bir sınıfını oluştururlar. Proteinlerin parçalanmasında rol oynamaları özellikle stres koşullarıyla ilişkilidir. Bakteri ve Ökaryotlar'ın aksine, Arkea'daki enerji-bağımlı proteoliz hakkında çok az şey bilinmektedir ve Cip ailesine ait proteazlar hakkında bir rapor bulunmamaktadır. Bu çalışmada, ilk kez, termofilik bir arkea olan Thermoplasma volcanium'un Cip P benzeri periplazmik (PSP) ve membrane bağlı serin proteaz (MSP) enzim genleri E. colfâe klonlanmış ve anlatımı sağlanmıştır. 55°C de gerçekleştirilen PZR amplifikasyonları sonucu, PSP ve MSP genleri için sırasıyla 971 ve 1571 VIbç uzunluğunda fragmentler elde edilmiştir. Bu fragmentler pDrive klonlama vektörlerine bağlanmış ve kompetan E. coli hücrelerine aktarılmışlardır. Rekombinant klonlar mavi/beyaz koloni ayrımına göre seçilmişlerdir. Olası recombinant plazmitler restriksiyon enzimi kesimleriyle analiz edilmiştir. Üç pozitif klonun (E. coli TG-S1, E. coli TG-S4 ve E. coli TG-M1) serin proteaz aktiviteleri kromojenik oligopeptit substratlar kullanılarak spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. Bu sonuçlar, klonlanan PSP ve MSP genlerinin E. colfde, kendi promotorlarının kontrolünde, başarıyla anlatıldığını göstermiştir. Aynca, PSP geninin 5' ucuna, pQE 30 anlatım vektöründe, 6xHis takısı eklenerek heterolog olarak anlatımı çalışılmıştır. Oluşturulan pQE anlatım yapıları, kompetan E.coli TG1 hücrelerine transformasyonla aktarılmışlardır. Pozitif klonlar, Anti-His HRP konjügatı ve DAB substratı kullanılarak koloni hibridizasyonu ile belirlenmiştir. Gerçek recombinantlann seçilmesi için, bu kolonilerden izole edilen plazmitler restriksiyon enzimi kesimleriyle analiz edilmiştir. 6xHis-PSP füzyon proteinin rekombinant E. coli TG-pQE-S1.7 susunda anlatıldığı işlevsel analizler ve SDS-PAGE yöntemiyle doğrulanmıştır. NCBI domain araştırması ve Clustal W 1.82 programıyla yapılan çoklu dizi hizalamaları, Tp. volcanium'xxn PSP ve MSP genleri ile çeşitli bakteriyel ATP bağımlı ClpP'ler arasında homoloji olduğunu göstermiştir. Signal P 3.0 servis sağlayıcısı ile yapılan sinyal peptit araştırması, MSP gen dizisi içinde Gram (+) bakteril erdeki diziler ile homolog bir sinyal peptitin var olabileceğini göstermiştir.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT CLONING AND EXPRESSION OF PERIPLASMIC (CLPP-LIKE) AND MEMBRANE-BOUND SERINE PROTEASE GENES OF THERMOPLASMA VOLCANIUM IN ESCHERICHIA COLI DEMİROK, Burçak M. Sc., Department of Biological Sciences Supervisor : Prof. Dr. Semra KOCABIYIK January 2006, 149 pages Serine proteases are a family of proteases that utilize an activated serine residue in the substrate-binding pocket to catalytically hydrolyze peptide bonds. Enzymes which belong to this family, with a diverse array of metabolic and regulatory fiinctions, play critical roles in cell physiology and pathology. 'Clp's are a class of ATP dependent serine proteases which are composed of a protease (ClpP) and an ATPase (ClpA or ClpX) component. Their involvements in degrading proteins are especially implicated under stress conditions. In contrast to members of Bacteria and Eukarya, little is known about the energy-dependent proteolysis and there is no report on Clp family proteases in Archaea. In this study, for the fist time, a periplasmic Clp P-like (PSP) and a membrane bound serine protease (MSP) genes from thermophilic archaeon Thermoplasma volcanium GSS1 were cloned and expressed in E. coli. PCR amplifications at 55 ° C yielded unique fragments of 971 and 1521bp, for PSP and MSP genes, respectively, which were ligated to p-Drive cloning vectors and introduced into IVE.coli TGI competent cells. Recombinant clones were screened depending on blue/white colony selection. Putative recombinant plasmids were analyzed by restriction enzyme digestions. Serine protease activities of the three positive clones (E. coli TG-S1, E. coli TG-S4 and E. coli TG-M1) were determined spectrophotometrically by using chromogenic oligopeptide substrates. These results indicated that cloned PSP and MSP genes were successfully expressed in E. coli under the control of their own promoters. Heterologous expression of PSP gene was also attempted by adding 6xHis tag to the 5' end of the PSP gene in pQE 30 expression vector. Competent E.coli TGI cells were transformed by pQE expression constructs. Positive clones were detected on colony blots using Anti-His HRP conjugates and chromogenic DAB substrate. Plasmids of these colonies were analyzed by restriction digestions to select the true recombinants. Expression of the 6xHis-PSP fusion protein from the recombinant E. coli TG- pQE-S1.7 strain was confirmed by functional analysis and SDS-PAGE. An NCBI domain search and multiple sequence alignment using Clustal W 1.82 program indicated homologies between PSP and MSP of Tp. volcanium and various bacterial ATP dependent ClpPs. Signal peptide search using Signal P 3.0 server predicted a signal peptide sequence in MSP homologous to that of Gram (+) bacteria.
Benzer Tezler
- Cloning of TaqI endonuclease gene into E.coli and isolation of the enzyme by using pMAL-p2 vector system
pMAL-p2 vektör sistemi kullanılarak TaqI restriksiyon enzim geninin E.coli'ye klonlanması ve enzimin izolasyonu
PEMBE HANDE ÖZDİNLER
- Cloning of thermostable glucose isomerase of thermus thermophilus in escherichia coli
Thermus themophilus'ün ısıl kararlı glikoz izomerazının escherichia colı'ye klonlanması
BERNA SARIYAR
- Molecular studies on the cloning and expression of human beta interferon gene in E. coli
İnsan beta interferon geninin klonlanması ve E.coli'de ekspresyonu üzerine moleküler çalışmalar
ZALİHE OMAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
BiyoteknolojiBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Polietilen tereftalat (PET) türü plastiği parçalayan petaz enziminin escherichia coli'de biyoteknolojik olarak üretimi
Biotechnologically production of polyethylene terephthalate (PET) type plastic degrading enzyme petase in escherichia coli
BEGÜM ESRA AYTAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞULE ARI
- Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli
TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu
ELİF ÖZKIRIMLI
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BETÜL KIRDAR