Geri Dön

Identification of interaction between septin3 and p60-katanin (KATNA1) proteins

Septin3 ve p60-katanin (KATNA1) proteinlerinin etkileşiminin aydınlatılması

PDF İndir

  1. Tez No: 486571
  2. Yazar: BURCU SUCU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 106

Özet

p60-katanin, katanin proteininin küçük alt birimi olup üzerinde çok çalışılan, bölünebilen hücrelerde mitoz sırasında mikrotubul dinamiğini etkileyen ve nöronlarda özellikle nöronal dallanma oluşumu açısından önemli bir proteindir. C-ucunda bulunan AAA bölgesi proteine ATPaz özelliği kazandırmakta, dolayısıyla p60-katanin mikrotubulleri kesmek suretiyle büyük parçalardan küçük mikrotubul parçaları oluşumunu sağlamaktadır. Mikrotubullerin bu şekilde kesilmesi hem bölünen hücrelerde hem de bölünmeyen hücrelerde yani nöronlarda akson ve dendrit gibi proseslerin dallanmalarında önemli rol oynamaktadır. Üzerinde çok çalışılan önemli bir protein olmasına rağmen p60-katanin'in hangi proteinlerce bu görevi düzenlendiği tam olarak aydınlatılamamıştır. p60-katanin'in bilinen regülatörlerinden birisi katanin'in diğer alt birimi olan p80-katanin'dir. Hücre içinde p60-katanin ile p80-katanin heterodimer oluşturmaktadır, böylece p60-katanin ATPaz aktivitesi sayesinde mikrotubulleri kesebilmektedir. Laboratuvarımızda yüksek lisans tezi olarak gerçekleştirilen p60-katanin ile etkileşen proteinleri aydınlatmak için kullanılan Y2H (maya ikili hibrid) tarama sistemi ile insan beyin cDNA kütüphanesi taranmış ve p60-katanin ile 22 proteinin etkileşimi aydınlatılmıştır. p60-katanin ile etkileştiği tespit edilen bu proteinlerden Septin3, presinaptik terminallerde bulunması, sinaps formasyonundaki rolleri, akson hedeflenmesindeki ve nöronal diferansiyasyondaki etkileri göz önünde bulundurularak bu çalışmada incelenmek üzere seçilmiştir. Septin3, Septin ailesinin bir üyesi olup GTPaz özelliğine sahip bir proteindir. Memelilerde 13 adet Septin geni 30'dan fazla Septin izoformunu kodlar. Septinler hücre içinde hetero-oligomerler ya da homo-oligomerler halinde bulunur. Oligomer oluşumu sırasında da GTP hidrolizi sonucu açığa çıkan enerjiyi kullanırlar. Bu açıdan GTPaz aktivitesi septinler için önem taşımaktadır. Septinlerin GTPaz aktivitesini etkileyen birçok amino asit bulunmaktadır. Bu amino asitlerin GTPaz aktivitesi üzerine etkileri Septin alt sınıfları arasında farklılık göstermektedir. Septin proteinlerinin çoğu birçok dokuda eksprese edilmektedir. Biyokimyasal saflaştırma çalışmaları göstermiştir ki, septinler hetero-oligomer oluşumu sırasında eksprese edildikleri hücreye göre farklılık göstermektedir. Septinler, gen sekanslarındaki benzerliğe göre SEPT2, SEPT6, SEPT7 ve SEPT3 olmak üzere dört alt sınıfa ayrılmışlardır. Bu açıdan oluşan septin filamentleri; SEPT2/6/7/3 olmak üzere belirli bir kombinasyon doğrultusunda oluşmaktadır. Septin3 özellikle beyinde eksprese edilmektedir. Diğer septinler gibi hetero-oligomer oluşumuna katılmaktadır ve hetero-oligomerin uçlarında yer almaktadır. Bunun yanı sıra, bazı septinlerden farklı olarak homo-dimer de oluşturmaktadır. Septinlerin birçok hastalık ile ilişkileri ortaya koyulmuştur. Özellikle merkezi sinir sisteminde yoğun olarak bulunan Septinlerin Parkinson, Alzheimer, şizofreni ve kalıtsal nörolojik amtropy gibi hastalıklarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada, Septin3 ile p60-katanin'in etkileşimini aydınlatabilmek için öncelikle sıçan beyin lizatının kullanıldığı ko-immünopresipitasyon (ko-IP) yöntemiyle Septin3 - p60-katanin etkileşimi incelenmiştir. Ko-immünopresipitasyon sonucunda, Septin3 ve p60-katanin proteinleri birbirlerine bağlanmışlardır. Sadece boncuk ve spesifik olmayan IgG kontrollerinde de bağlanma gözlemlenmemesi, etkileşimin spesifik olarak Septin3 ve p60-katanin arasında gerçekleştiğini ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, Septin3 ve p60-katanin sıçan beyninde etkileşmektedir. Ardından immünositokimya deneyleri ile Septin3 ve p60-katanin proteinlerinin lokalizasyonu primer kortikal nöronlarda gözlemlenmiştir. İmmünositokimya deneylerinde endojen Septin3 ve p60-katanin proteinleri spesifik antikorlar kullanılarak görselleştirilmiştir. Nöron görüntülerine göre Septin3 proteinleri literatürde de belirtildiği gibi aksonlarda gözlemlenmiştir. Septin3 ve p60-katanin proteinleri özellikle nöronların gövdesinde ko-lokalize olarak bulunmaktadır. Ardından, Septin3 proteini, büyük hücre yapısına sahip olan ve görüntülenmesi açısından sağlayacağı avantaj düşünülerek RFL6 hücrelerinde fazla-eksprese ettirilmiş ve immünositokimya deneyleri ile Septin3'ün hücre içindeki formasyonu gözlemlenmiştir. Septin3 proteini, literatürde bazı septinler için belirtildiği gibi filament yapı oluşturmuştur. Septinlerin filament oluşumunda GTPaz aktivitesi önemlidir. Bu açıdan Septin3 proteininin GTPaz aktivitesi için kritik olan iki amino asit, lizin 208 ve arjinin 280, ayrı ayrı ve birlikte mutasyona uğratılarak, mutasyonların Septin3'ün GTPaz aktivitesi üzerine etkisi ölçülmüştür. Arjinin 280'de gerçekleştirilen mutasyon, lizin 208'de gerçekleştirilen mutasyona oranla Septin3'ün GTPaz aktivitesini daha çok düşürmüştür. En düşük GTPaz aktivitesi, her iki amino asidin mutasyona uğratılması sonucu kaydedilmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkarak, her iki mutasyonu içeren Septin3 proteini RFL6 hücrelerinde fazla-eksprese ettirilerek immünositokimya deneyleri ile gözlemlenmiştir. Mutant Septin3 proteinleri nokta şeklinde hücre sitoplazmasında ve hücre zarında mikrotubullerle ko-lokalize olarak birikmiş şekilde gözlemlenmiştir. Ardından, wild-type ve her iki mutasyonu içeren Septin3 konstrakları RFL6 hücresinde p60-katanin ile birlikte fazla-eksprese ettirilmiş ve hücreler immünositokimya analizlerine tabi tutulmuştur. Wild-type Septin3'ün ve p60-katanin'in birlikte eksprese ettirildiği hücreler sadece wild-type Septin3 eksprese eden hücrelere kıyasla daha küçük gözlemlenmiştir. Ayrıca bu hücrelerin düzensiz bir mikrotubul dinamiğine sahip olduğu da görülmüştür. Bunun yanı sıra, Septin3 proteini sadece Septin3 eksprese ettirilen hücrelerde uzun, fırça şeklinde filamentler ya da yoğun Septin3 demetleri şeklinde gözlemlenirken, p60-katanin ile birlikte eksprese ettirildiklerinde hücre içinde kısa Septin3 filamentleri oluştuğu gözlemlenmiştir. Her iki mutasyonu birden içeren Septin3'ün ve p60-katanin'in birlikte fazla-eksprese ettirildiği hücrelerde beklenildiği üzere Septin3'ün filament oluşturamadığı gözlemlenmiştir. Yanı sıra, mikrotubullerin düzensiz ağ yapısına sahip olduğu ve Septin3 proteinleriyle ko-lokalize olduğu gözlemlenmiştir. Son olarak, Septin3'ün ve p60-katanin'in birbirleriyle etkileşen bölgelerini aydınlatabilmek için p60-katanin'in farklı fonksiyonel bölgelerini içeren gen sekansları FLAG etiketli memeli ekspresyon vektörüne, Septin3'ün farklı fonksiyonel bölgelerini içeren gen sekansları Myc/His etiketli memeli ekspresyon vektörüne aktarılmıştır. Full length Septin3 ile p60-katanin'in konstrakları ve p60-katanin ile Septin3'ün konstrakları olacak şekilde kolay transfeksiyon olabilen HCT116 hücrelerinde fazla-eksprese ettirilmişlerdir. Hücre lizatları toplanmış ve ko-IP analizleri gerçekleştirilmiştir. Ko-IP deneylerinde FLAG etiketli p60-katanin proteinleri FLAG etiketli rezin ile çöktürülmüş, birlikte çöken Myc/his etiketli Septin3 proteinleri ise Myc etiket antikoru ile tespit edilmiştir. Sonuçlara göre, p60-katanin proteini çoğunlukla Septin3 ile p60-katanin'in ATPaz bölgesi aracılığıyla etkileşmektedir. İlaveten, Septin3 proteini p60-katanin ile GTPaz bölgesi aracılığı ile etkileşime girmektedir.

Özet (Çeviri)

p60-katanin, the small subunit of katanin protein, is an important protein regulating microtubule dynamics of mitotic cells during mitosis and neuronal branching in post-mitotic cells. The C-terminal AAA (ATPases Associated with diverse cellular Activities) domain containing ATPase activity carries microtubule severing function and causes formation of short microtubule pieces from long microtubules. Microtubule severing is an important cellular event which enables rapid re-organization of microtubule network during cell division in the cells. Besides, microtubule severing takes important roles in the formation and branching of neuronal processes such as axons and dendrites. Although p60-katanin is a protein widely worked on, neither its functioning mechanisms nor its regulatory partners are clearly determined. There are a few proteins identified so far that physically interact with p60-katanin. One of these proteins is the other subunit of katanin: p80-katanin. These two subunits exist as a heterodimer in cells. In our laboratory, p60-katanin interacting proteins were identified by Yeast Two Hybrid screening system. Human brain cDNA library was screened and twenty-two candidate proteins were identified. Septin3, present in pre-synaptic termini, having roles in synapse formation, has been chosen in this study. Septin 3 is a novel member of the Septin subfamily of GTPase domain proteins. The septin family consists of multiple genes and protein isoforms; in mammals, 13 septin genes encode for over 30 protein isoforms. Mostly all Septin proteins are expressed in many tissues, but Septin3 appears to be primarily expressed in brain. Septins are abundant in the central nervous system and associated with many neurological diseases such as Parkinson's, Alzheimer's, schizophrenia, and hereditary neuralgic amyotrophy. In this study, in order to analyze the interaction between p60-katanin and Septin3, co-immunoprecipitation assays were performed using rat brain lysate, and it was found that p60-katanin interacts with Septin3. Then, immunocytochemistry (ICC) was performed to monitor localization of endogenous Septin3 and p60-katanin proteins. Based on the ICC results, Septin3 mainly localizes along axons and p60-katanin mostly resides in cell bodies. These two proteins have been observed as co-localized along axons and cell body. In order to observe filament formation of Septin3, wild-type Septin3 construct was overexpressed in RFL6 cells, for better visualization due to its big and flat nature, and they were subjected to ICC. Wild-type Septin3 protein formed form brush-like filaments. Since the GTPase activity of septin proteins is important for filament formation, two critical amino acids, Lys208 and Arg280, for the GTPase activity of Septin3 were mutated both separately and together by site-directed mutagenesis. A mutation on Arg280 showed greater inhibitory effect on the GTPase activity of Septin3 than a mutation on Lys208. The lowest GTPase activity among Septin3 mutants were detected when both amino acids were mutated. Double mutant Septin3 construct was overexpressed in RFL6 cells and subjected to ICC. It was found that double mutant Septin3 protein was observed as being punctiform and accumulating on the cell membranes where they co-localized with microtubules. Septin3 wild-type and double mutant constructs were overexpressed in RFL6 cells together with p60-katanin and the cells were subjected to ICC. Wild-type Septin3 and wild-type p60-katanin co-transfected cells were observed to be smaller and to have disorganized microtubule structure than the cells expressing only Septin3. In addition, short Septin3 filaments were observed to be localized around p60-katanin proteins, whereas brush-like Septin3 filaments were observed in the cells expressing only Septin3. Double mutant Septin3 and wild-type p60-katanin co-transfected RFL6 cells have been observed to lack the ability to form septin filaments and they were overlaying with microtubules which seemed to have lost their regular meshwork. In order to identify the interaction domains of p60-katanin and Septin3, deletion constructs of p60-katanin and Septin3 were generated by cloning rat p60-katanin fragments into FLAG-tagged mammalian expression vector and by cloning rat Septin3 fragments into Myc/His-tagged mammalian expression vector. Then the constructs were overexpressed in human colon carcinoma cell line, due to its easily transfectable nature, and the total protein were subjected to co-immunoprecipitation (co-IP) assays. According to co-IP result, p60-katanin strongly binds to Septin3 via when it has ATPase domain at C-terminal end. In addition, Septin3 binds to p60-katanin through its GTPase domain in between 67th and 217th amino acids.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    540785

    Meme kanseri yeni nesil dizileme verilerinde gen ifadesi ile mikroRNA ifadesi arasındaki karşılıklı etkileşimin analizi

    Analysis of interplay between gene expression and miRNA expression in breast cancer next generation sequencing data

    SELCEN ARI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ALPER YILMAZ

  2. Tez No

    498276

    Ceftriaoxone'un fenilalanin ve DNA ile etkileşiminin incelenmesi ve antimikrobiyal etkilerinin belirlenmesi

    Identification of interactions of ceftriaoxone with phenylalanine and DNA and determinaton of their antimicrobial activities

    FADHILA M.A. OTHMAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyoteknolojiKastamonu Üniversitesi

    Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. YASEMİN ÇELİK ALTUNOĞLU

  3. Tez No

    270168

    Yeşil çay polifenolleri ile süt proteinleri arasındaki etkileşimlerin ve süt ürünlerinde neden olabileceği işlevsel değişimlerin tanımlanması

    Identification of interactions between green tea polyphenols and resultant functional modifications in dariy products

    ELİF AVCI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Gıda MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. YAŞAR KEMAL ERDEM

    YRD. DOÇ. DR. ZERRİN YÜKSEL

  4. Tez No

    356971

    Identification of interaction partners of unzipped, a novel cell adhesion molecule

    Yeni hücre adhezyon molekülü unzipped'in etkileşim partnerlerinin belirlenmesi

    GAMZE AKGÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ARZU ÇELİK FUSS

  5. Tez No

    284597

    Resveratrolün süt proteinleri ve Maillard tepkimesine etkileri

    Effects of resveratrol on milk proteins and Maillard reaction

    FURKAN ACAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    Gıda MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. YAŞAR KEMAL ERDEM

Geri Dön