Selective enrichment of glycoproteins using magnetic microspheres and their sensitive detection with surface enhanced Raman spectroscopy
Glikoproteinlerin manyetik mikroküreler kullanılarak seçici zenginleştirilmesi ve yüzey destekli Raman spektroskopisi ile hassas tayini
- Tez No: 493909
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Kimya Mühendisliği, Bioengineering, Biotechnology, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 95
Özet
Glikoproteinler metabolizmada hücre-hücre etkileşimi, sinyal iletimi, protein katlanması, molekül tanıma ve konakçı-patojen etkileşimi gibi konularda kritik rol oynamaktadır. Ayrıca, ilaç endüstrisinde ilacın kararlılığı, farmokokinetik ve imunojenik özellikleri üzerindeki etkisi sebebiyle glikoproteinler sıklıkla kullanılmaktadır. Antikor ve antikor türevli moleküller ilaç endüstrisinin başlıca üyelerindendir. Antikorların en popülerlerinden biri de İmmunoglobulin G (IgG) glikoproteini olup, yüksek saflıkta üretimi önemlidir. Çalışmanın ilk bölümünde, kompleks serum ortamından IgG glikoproteinini saflaştırmak için manyetik, silika temelli bir sorbent kullanılmıştır. IgG saflaştırmak amacıyla pH-bağımlı diol gruplarına seçimli bağlanmayı sağlayan bir sistem olarak sorbent, amino fenil boronik asit (APBA) grubu ile fonksiyonalize edilmiştir. Adsorpsiyon-desorpsiyon mekanizmaları incelenmiş ve optimum koşullar araştırılmıştır. Bağlayıcı tampon çözelti olarak 0.05 M pH 8.5 HEPES kullanılmıştır. IgG adsorpsiyon davranışı Langmuir modeli ile uyumlu bulunmuştur; bu da adsorpsiyonun tek tabaka halinde ve homojen olarak gerçekleştiğini göstermektedir. IgG maksimum adsorpsiyon kapasitesi 84 mg.g-1 olarak hesaplanmıştır. Adsorpsiyon işleminden sonra glikoproteini saflaştırmak için en iyi desorpsiyon ortamı incelenmiştir. IgG'nin optimum izolasyonu 0.2 M NaCl içeren 1 M Tris-Cl (pH: 8.5) desorpsiyon ortamında 5 mg sorbent kullanarak elde edilmiştir. Saflaştırma işleminden sonra serum içerisindeki IgG glikoproteini 4 kat konsantre edilmiş olup, elüsyonlarda 80% saflığında IgG gözlenmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında ise, etkili bir saflaştırma işleminden sonra; patojen tanısı, kanser, diyabet gibi günümüz hastalıklarının erken teşhisi ve etkili farmasötiklerin geliştirilmesi kapsamında önemli bir araç olan glikan yapıların hassas ve hızlı tayini incelenmiştir. Bu amaçla, diol gruplarına seçimli olarak bağlanmayı sağlayan merkapto fenil boronik asit (MPBA) ile fonksiyonalize edilmiş gümüş kabuğa sahip manyetik polimetakrilat mikroküreler (MPBA-Ag@MagPMMS) yardımıyla Yüzeyce Zenginleştirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS) tekniği kullanılmıştır. Model protein olarak birbirine oldukça benzer yapıda olan RNase A proteini (negatif kontrol) ve RNase B glikoproteini bu özel sandviç sistemiyle kullanılmıştır. Adsorplanan glikoproteinlerin karakterizasyonu ve nicel ölçümü bu teknikle gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemle, 0.1 ng/mL, yaklaşık 10-15 M, derişim seviyesine kadar RNase B tayini kolaylıkla yapılabilmiştir
Özet (Çeviri)
Glycoproteins play critical roles including cell−cell interaction; signal transduction, protein folding, molecular recognition and host-pathogen interactions in metabolism. Glycoproteins are also widely used in pharmaceutical industry because of effectiveness in drug stability, pharmacokinetic and immunogenicity. Antibodies and antibody-derived molecules are the leading family of biopharmaceuticals. One of the most popular antibody is Immunoglobulin G (IgG) and its production at high levels of purity is an important process necessity. In the first part of this study, a magnetic silica based sorbent was used to purify IgG glycoprotein from complex serum media. The sorbent was functionalized with amino phenyl boronic acid (APBA) group to obtain pH-dependent diol-sensitive system for IgG purification. Adsorption-desorption mechanism was observed and optimum conditions were studied. 0.05 M HEPES buffer, pH 8.5, was used as binding buffer. IgG adsorption behavior was found compatible with Langmuir model; it shows that adsorption has occurred as a single layer and homogeneously. Maximum adsorption capacity of IgG was calculated as 84 mg.g-1. After the adsorption process, optimization of the desorption media was performed. Optimum isolation of IgG was obtained with 5 mg sorbent in 1 M Tris-Cl (pH 8.5) with 0.2 M NaCl. After the purification process, IgG in serum was concentrated 4-fold and IgG was found approximately 80% purity in elution buffer. In the second part of this study, after the effective purification step of glycoproteins, sensitive and fast detection of these glycan structures were investigated for possible use in pathogen detection, early diagnosis of today's important disorders like cancer, diabetes and effective pharmaceuticals production. For this purpose, Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) technique was used with diol sensitive mercapto phenyl boronic acid (MPBA) functionalized Ag nanoshell coated magnetic polymethyacrylate microspheres (MPBA-Ag@MagPMMS). As model proteins, much similar RNase A protein (negative control) and RNase B glycoprotein were used with this special sandwich system. Characterization and quantification of adsorbed glycoproteins were realized with this technique. RNase B concentrations down to 0.1 ng/mL, nearly 10-15 M, could be detected with this method effectively.
Benzer Tezler
- Glikopeptitlerin kütle spektrometrik analizleri için yeni bir biyoanalitik yöntem geliştirilmesi ve insan C1-inhibitör proteininin ayrıntılı bölgeye özgü glikozilasyon analizinin gerçekleştirilmesi
Development of a novel bioanalytical method for mass spectrometric analysis of glycopeptides and achieving in-depth site specific glycosylation analysis of human C1-inhibitor
HACI MEHMET KAYILI
- Deneysel meme tümörü modeline bağlı gelişen karaciğer metastazında gliko-gen ifadelerinin ve glikoprotein yapılarının belirlenmesi ve biyobelirteç potansiyellerinin araştırılması
Determination of glyco-gene expressions and glycoprotein structures in liver metastasis due to experimental breast tumor model and investigation of biomarker potential
NEBİYE PELİN TÜRKER
Doktora
Türkçe
2023
BiyoteknolojiTrakya ÜniversitesiBiyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ELVAN BAKAR
- Nükleozidlerin zwitteriyonik monolitik kolonlar ile kapiler elektrokromatografi sisteminde ayrımı
Separation of nucleosides by zwitterionic monolithic columns in capillary electrochromtography systems
SİSEM EKTİRİCİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
KimyaHacettepe ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ADİL DENİZLİ
DOÇ. DR. FATMA YILMAZ
- Metal organik kafes yapılarının diol içeren biyomolekül tayini ve izolasyonu için kullanılabilirliğinin incelenmesi
Investigation of the usability of metal organic frameworks structures for detection and isolation of diol containing biomolecule
SEHER PARLAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATOŞ ÇİĞDEM KİP
- Siyalik asit içeren glikopeptitlerin hızlı ve etkin kütle spektrometrik analizleri için geçiş metal oksitleri kullanılarak seçimli olarak zenginleştirilmesi
Selective enrichment of sialic acid containing glycopeptides by using transition metal oxides for rapid and effective mass spectrometric analysis
BURAK TAVŞANLI