Glikopeptitlerin kütle spektrometrik analizleri için yeni bir biyoanalitik yöntem geliştirilmesi ve insan C1-inhibitör proteininin ayrıntılı bölgeye özgü glikozilasyon analizinin gerçekleştirilmesi
Development of a novel bioanalytical method for mass spectrometric analysis of glycopeptides and achieving in-depth site specific glycosylation analysis of human C1-inhibitor
- Tez No: 421306
- Danışmanlar: PROF. DR. BEKİR SALİH
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Kimya, Biotechnology, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2016
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 173
Özet
Post-translasyonel modifikasyonlarından en önemlileri arasında yer alan glikozilasyon, hücre içinde enzimatik reaksiyonlar sonucunda oluşmaktadır. Bu modifikasyona uğrayan proteinler, yapılarındaki değişiklik sonrasında hayati öneme sahip işlevler kazanmaktadır. Bu değişim sürecinin bozulması veya olağan dışı bir şekilde meydana gelmesi, çeşitli hücresel bozuklukların oluşmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, glikozilasyona uğramış proteinlerin işlevlerinin tam anlamıyla aydınlatılabilmesi için yapılarının güvenilir teknikler kullanılarak karakterize edilmeleri gerekmektedir. Kütle spektrometrisi, glikozilasyon bölgelerinin tespitinde kullanılan en uygun tekniklerden birisi olmasına rağmen glikopeptitlerin kütle spektrometrik yöntemlerle karakterize edilmesi çalışmaları çeşitli zorluklar içermektedir. Glikopeptitlerin analizlerinde karşılaşılan problemlerin ortadan kaldırılması amacıyla kütle spektrometrik analiz öncesinde glikopeptitlerin karmaşık biyolojik örnekler içerisinden verimli, hızlı ve seçimli olarak zenginleştirilmeleri gerekmektedir. Bu tezin ilk aşamasında glikopeptitlerin ve glikanların sürdürülebilir kütle spektrometrik analizlerinin yapılabilmesi için titanyum temelli Poli(vinilpirolidon) (PVP) içeren hibrit bir sol-jel malzeme kalsinasyon işlemi olmaksızın kolay ve hızlı bir yöntemle sentezlendi. Sentezlenen malzemenin detaylı yapısal karakterizasyonları çeşitli yöntemlerle (FT-IR, XRD, SEM, EDX) gerçekleştirildi. Çalışmada, kütle spektrometrisi temelli hızlı glikoproteomiks uygulamaları için titanyum temelli sol-jel malzeme içeren bir pipet ucu geliştirildi. Bu pipet ucunun zenginleştirme performansı glikan düzeyinde insan plazma glikomu üzerine, glikopeptit düzeyinde insan transferrin proteini üzerine yapılan çalışmalarda belirlendi. Geliştirilen biyoanalitik yöntemin seçiciliğinin yanı sıra hassasiyetinin de çok yüksek düzeyde olduğu (femtomol düzeyinde) ticari TiO2 ile kıyaslandığında tespit edildi. Titanyum temelli glikopeptit zenginleştirme pipet ucunun tekrarlanabilirlik, kapasite ve geri kazanım testleri yapıldı. Son olarak glikopeptitlerin analizi için geliştirilen bu yeni biyoanalitik yöntemin karmaşık biyolojik örneklerdeki glikopeptit zenginleştirme performansı, bir glikoprotein karışımı ve insan plazma glikoproteomunda test edildi. Tezin ikinci kısmında, yüksek oranda glikozillenmiş insan plazma proteini ve serin proteaz inhibitörü olan C1-İnh proteininin bölgeye özgü glikozilasyon analizleri ileri kütle spektrometrik teknikler kullanılarak gerçekleştirildi. C1-İnh çeşitli proteazlar ile peptit birimlerine parçalandı ve elde edilen (gliko)peptitlerin analizi ters faz sıvı kromatofrafisi (RP) bağlı elektrosprey iyonlaşmalı iyon tuzaklı (IT) veya RP-gözenekli grafitize karbon kolonu (PGC) bağlı elektrosprey iyonlaşmalı dört kutuplu uçuş-zamanlı (QTOF) ardışık MS/MS kabiliyetine sahip kütle spektrometrileri ile gerçekleştirlidi. MS/MS parçalanma ürünleri, çarpışma ile indüklenmiş ayrıştırma (CID), çoklu-enerji CID ve elektron transferi ile gerçekleşen ayrıştırma (ETD) teknikleri ile elde edildi. C1-İnh proteini üzerine yapılan analizler C1-İnh proteininin yüksek oranda glikozillenmiş N-terminal bölgesine sahip olduğunu gösterdi. Çekirdek-1 glikan türüne sahip 9 tanesi bu çalışma ile ilk kez belirlenen 13 O-glikozilasyon bölgesi karakterize edildi. İlave olarak, 16 farklı O-glikan içeren yüksek oranda glikozillenmiş bir bölge Thr82-Ser121 peptidi üzerinde tespit edildi. Ayrıca C1-İnh proteininin bölgeye özgü glikozilasyon analizi ile altı N-glikozilasyon bölgesinden beşi (Asn25, Asn69, Asn238, Asn253 ve Asn352) belirlendi. C1-İnh proteininin N-glikanları, bağlanmaya özgü siyalik asit türevlendirme işlemi sonrasında MALDI-TOF/TOF-MS/MS ile analiz edildi. Elde edilen veriler C1-İnh proteininin özellikle O-glikozilasyon açısından çok büyük miktarda glikozillenmiş olduğunu göstermiş ve C1-İnh ait glikozilasyon bölgeleri üzerine işlevsel çalışmalar için bir temel oluşturmuştur.
Özet (Çeviri)
Glycosylation is the one of the most important post-translational modification which is occurred by the results of enzymatic reactions in a cell. Proteins which are exposed to this modification gains crucial functions after the differentiation of their structure. Occurrence in an extraordinary way or failure of this differentiation processes of proteins cause the variety of cellular changes. Therefore, modifications should be analyzed by the reliable techniques for a complete identification of glycosylated protein functions. Even mass spectrometry is one of the most useful method for the identification of glycosylation sites, mass spectrometric glycopeptide characterizations still have lots of difficulties. To get rid of these difficulties that encountered in the analysis of glycopeptides, it is necessary to enrich glycopeptides in an efficient, fast and selective way from the biological samples before the mass spectrometric analysis. In the first part of dissertation, titania-based sol-gel material containing PVP was synthesized by a facile and quick method without a calcination step to maintain sustainable mass spectrometric analysis of glycopeptides and glycans. In detail structural chracterization of the synthesized sol-gel material was achieved using several tecniques (FT-IR, XRD, SEM, EDX). In the study, a pipette-tip packed with titania-based sol-gel material for mass spectrometry based glycoproteomics was developed. The enrichment performance of the developed pipette-tip was evaluated working on plasma glycome at the glycan level, and human transferrin at the glycopeptite level. The sensitivity of the developed bioanalytical method was found to be very high (at femtomole level), as well as selectivity when compared with commercial TiO2. Also, the repeatability, recovery and capacity of titania-based glyco enrich-tip was examined. Finally, this new bioanalytic technique for glycopeptide analysis was tested in a glycoprotein cocktail and a whole blood plasma glycoproteome to evaluate the glycopeptide enrichment performance in real and complex biological samples. In the second part of the dissertation, site-specific glycosylation analysis of C1-İnh, is a serpin protease inhibitor and a highly glycosylated plasma glycoprotein, was performed by advanced mass spectrometric techniques. C1-Inh was cleaved with various proteases and the (glyco)peptides were analyzed by reversed phase (RP)-electrospray ionization (ESI)-ion trap (IT)-MS/MS and RP-porous graphitized carbon (PGC)-ESI-quadrupole time of flight-MS/MS. Fragmentation was achieved by collision induced dissociation (CID), multiple-energy dissociation CID, and electron transfer dissociation (ETD). Detailed information on C1-Inh glycosylation was obtained revealing an extensively O-glycosylated N-terminal region. Thirteen O-glycosylation sites carrying core-1 type O-glycans were characterized, with nine of them being novel sites. In addition, we identified another heavily O-glycosylated part of C1-Inh spanning from Thr82-Ser121 with up to 16 O-glycans attached. Likewise, we covered five (Asn25, Asn69, Asn238, Asn253, and Asn352) of the six N-glycosylation sites of C1-Inh by site-specific glycosylation analysis. The glycoforms were in accordance with results on released N-glycans by MALDI-TOF/TOF-MS/MS after linkage-specific sialic acid derivatization. Our data indicate a vast glycosylation of C1-Inh, in particular O-glycosylation, and form the basis for further functional studies on C1-Inh glycosylation.
Benzer Tezler
- Development of a new bioanalytical method for mass spectrometric analysis of glycopeptides using hydrophilic interaction-based sorbents
Hidrofilik etkileşime dayalı sorbentler kullanılarak glikopeptitlerin kütle spektrometrik analizi için yeni bir biyoanalitik yöntemin geliştirilmesi
ABDULBASİT RAMADAN ALMAHDİ ALTOUMİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyokimyaKarabük ÜniversitesiBiyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HACI MEHMET KAYILI
PROF. DR. BEKİR SALİH
- Siyalik asit içeren glikopeptitlerin hızlı ve etkin kütle spektrometrik analizleri için geçiş metal oksitleri kullanılarak seçimli olarak zenginleştirilmesi
Selective enrichment of sialic acid containing glycopeptides by using transition metal oxides for rapid and effective mass spectrometric analysis
BURAK TAVŞANLI
- Development of a bioanalytical method for rapid and efficient N-glycan analysis of therapeutic proteins by mass spectrometric methods
Kütle spektrometrik yöntemlerle terapötik proteinlerin hızlı ve etkili N-glikan analizi için biyoanalitik bir yöntemin geliştirilmesi
ZIDAN MASOUD EMHAMED RAGOUBI
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyokimyaKarabük ÜniversitesiBiyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Assist. Prof. Dr. HACI MEHMET KAYILI
PROF. DR. BEKİR SALİH
- Analysis of human plasma N-glycopeptides by mass spectrometry using high-pH fractionation and hilic-based strategies
İnsan plazma N-glikopeptitlerinin kütle spektrometresi ile yüksek pH fraksiyonlama ve hılıc tabanlı stratejiler kullanılarak analizi
NABIL TAHHAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyomühendislikKarabük ÜniversitesiBiyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HACI MEHMET KAYILI
- Bölgeye özgü glikolizasyon analizlerinde kullanılan çarpışmalı fragmantasyon tekniklerinin glikopeptit tanımlama performanslarının kıyaslanması
Comparison of glycopeptide identification performances of collisional fragmentation techniques used in site specific glycosylation investigation
SEMA BALTACI
