Geri Dön

Evolutionary engineering and physiological analysis of antimycin-a resistant Saccharomyces cerevisiae

Antimisin-a dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin evrimsel mühendisliği ve fizyolojik analizi

PDF İndir

  1. Tez No: 511290
  2. Yazar: ALİCAN TOPALOĞLU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 68

Özet

Saccharomyces cerevisiae mayası, iyi bilinen genetik ve metabolik altyapısı ve üretim kolaylığı açısından yaygın olarak kullanılan bir ökaryotik model organizmadır. Genomu 1996 yılında sekanslanmıştır ve sekansı bilinen ilk ökaryotik organizmadır. Ayrıca, insan genomu ile karşılaştırıldığında çok sayıda homolog geni vardır. Bazı özellikleri sebebiyle, mitokondriyel fonksiyonları incelemek için de uygun bir model organizmadır. Mitokondria organeli hakkında yapılan birçok keşif S. cerevisiae model organizması kullanılar yapılmıştır. En önemlisi, fakültatif bir organizma olması sebebiyle, mitokondriyal disfonksiyon durumunda dahi yaşayabilen ve mitokondriyel DNA mutasyonlarına karşı çeşitli sağkalım mekanizmalarına sahip olan bir mikroorganizmadır. Mitokondri, temel işlevi oksidatif fosforilasyon ile enerji üretmek olan bir organeldir. Bu fonksiyonun yanı sıra, termojenez, apoptoz, lipit ve sterol sentezi ile kalsiyum depolama gibi farklı görevlere de sahiptir. Mitokondri çift katlı zardan oluşmuş bir organeldir ve kendi mitokondriyel DNAsı (mtDNA) ve sitoplasmik ribosomlardan yapısal farklılıkları bulunan ribosomları bulunmaktadır. Mitokondri organeli yapısal ve fonksiyonel bazı farklılıkları sebebiyle daha çok prokaryotik bir mikroorganizmaya benzemektedir. Mitokondrideki fonksiyonel bozukluklar, başta sinir ve kas sistemi olmak üzere, en çok enerjiye ihtiyaç duyulan sistemlerde görülen mitokondriyal hastalıklara neden olabilir. Bu bozukluklar tipik olarak kardiyovasküler ve nörodejeneratif bozukluklara, görme ve işitme kayıplarına, diyabete, böbrek ve karaciğer bozukluklarına neden olur. Son yirmi yılda mitokondriyal bozuklukların patogenezinde birçok keşif yapılmasına rağmen, bu hastalıkları iyileştirmek için hala etkili tedaviler yoktur. Mitokondri ile ilgili genetik ve fonksiyonel bilgilerin çoğu S. cerevisiae model organizması üzerine yapılan çalışmalarla elde edilmiştir. Günümüzde genetik mutasyonların neden olduğu mitokondriyel hastalıkların çoğu, rekombinant DNA teknolojileri ve rasyonel metabolik mühendislik yaklaşımı kullanılarak S. cerevisiae modelleri üzerinde araştırılmaktadır. Fakat bu tip deneysel tasarımın, detaylı genetik bilgi gerektirmesi, organizma tarafından rekombinasyonun reddedilmesi ve öngörülemeyen fenotipik sonuçların görülebilmesi gibi bazı kısıtlamaları vardır. Bu kısıtlamalar nedeniyle, tersine metabolik mühendislik alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmaktadır. Bu bilgilerin ışığında, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik stratejisi ile, antimisin-A dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edilmesi ve bu direncin moleküler temelinin aydınlatılmasına yönelik ilk adım olan fizyolojik analizlerin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır.Antimisin-A, bc1 kompleksine bağlanan ve elektron transferini engelleyen bir mitokondriyal kompleks inhibitörüdür. Antimisin-A quinone molekülünün analoğudur ve mitokondriyel kompleks III ün bc1 üzerindeki Qi bölgesine bağlanır. Böylece Qo bölgesine bağlanan quinol molekülü üzerinden gelen elektronların transferi engellenir ve kompleks IV e aktarımı durur. Ayrıca antimisin-A mitokondrideki redoks reaksiyonlarının bozulmasına sebep olarak hücre içerisinde reaktif oksijen moleküllerinin (ROS) artışına sebep olur. Sonuç olarak, hücreler mitokondriyal oksidasyon yoluyla yeterli enerji üretemez ve hayatta kalmak için alternatif metabolik yolaklar bulmaya mecbur kalırlar. Antimisin-A dışında araştırmalarda sıklıkla kullanılan atpenin, oligomisin, stigmatelin veya siyanid gibi birçok farklı mitokondriyel inhibitör bulunmaktadır. Bu inhibitörler içinden, antimisin-A'nın seçilerek bu çalışmada kullanılmasına karar verilirken birçok faktör göz önünde bulundurulmuştur. Bunlar; antimisin-A'nın mitokondriyel kompleks III'e yüksek afinitede bağlanması, çok düşük konsantrasyonlarda bile yüksek inhibisyon etkisi göstermesi ve kullanımının daha güvenli oluşu gibi faktörlerdir. Bu çalışmada, antimisin-A dirençli mutantlar, hem referans suş hem de onun EMS-mutajenize popülasyonu ile yapılan seleksiyonlar ile başarılı bir şekilde seçilmiştir. Seleksiyon yöntemi olarak, hücrelerin mitokondriyal fonksiyona bağımlı hale getirilmesi amacıyla respiratif koşullarda kademeli olarak artan stres düzeyini, kesikli kültürde uygulama protokolü kullanılmıştır. 52. popülasyonda antimisin-A stres düzeyi 6.6 nM'a ulaşmış ve mutant bireyler bu son popülasyondan seçilmiştir. Referans suş seleksiyonundan 12 mutant, EMS-mutajenize edilmiş referans suş popülasyonun seleksiyonundan 15 mutant seçilmiştir. Bu mutantlar farklı antimisin-A konsantrasyonları altında tarandıktan sonra, en yüksek dirence sahip iki mutant suş belirlenmiştir. Referans suş seleksiyonundan elde edilen mutant bireylerin, 15 nM antimisin-A'ya karşı dirençli oldukları ve EMS-mutajenize edilmiş popülasyondan seçilen mutantların ise 50 nM antimisin-A'ya dirençli olduğu gözlemlenmiştir. Bu çalışma, literatür bilgisi dahilinde, evrimsel mühendislik stratejisi ile antimisin-A'ya dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edildiği ilk çalışmadır. Antimisin-A direncinin kalıcı olup olmadığını belirlemek için dirençli mutantlara genetik kararlılık testi uygulanmış ve referans suş seleksiyonundan elde edilen mutant bireylerden biri hariç tüm mutantlar genetik olarak kararlı bulunmuştur. Ek olarak, antimisin-A'ya dirençli bir mutant suşun, EMS mutajenezi yapılmadan doğrudan referans suştan elde edilmiş olması, antimisin-A'nın olası mutajenik etkilerine işaret etmektedir. Fizyolojik karakterizasyon deneyleri kapsamında yapılan çapraz direnç analizleri ile, antimisin-A dirençli mutantların ayrıca kafein, propolis, koniferil aldehit ve etanole karşı çapraz dirençli oldukları ortaya çıkarılmıştır. Benzer şekilde önceki çalışmalarda, etanole dirençli mutant haricindeki belirtilen diğer streslere dirençli mutantlar, aynı zamanda, antimisin-A'ya karşı çapraz dirençli bulunmuşlardır. Bu durum, bu mutantlar arasındaki benzer bir moleküler direnç mekanizmasına işaret etmektedir. Ayrıca etanol çapraz direnci de beklenen bir sonuçtur, çünkü seleksiyon prosedürü tek karbon kaynağı olarak etanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Dolayısıyla hücrelerin etanolü kullanacak şekilde metabolik değişikliklere gitmiş olamaları beklenen bir durumdur.Bu çalışmada antimisin-A dirençli S. cerevisiae mutantları evrimsel mühendislik stratejisi ile elde edilmiş ve fizyolojik karakterizasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Daha ileri çalışmalar için, genomik ve transkriptomik analizler yapılarak, işlevsel olmayan mitokondriyel kompleksin etkilerini ortadan kaldıran alternatif yolaklar bulunabilir ve olası farmasötik hedefler belirlenebilir.

Özet (Çeviri)

Saccharomyces cerevisiae is a well known eukaryotic model organism in terms of its clearly known genetic and metabolic basis and the ease of cultivation. Its genome was fully sequenced at 1996 and it was the first eukaryotic organisms which the genome was fully sequenced. Additionally, S. cerevisiae genome has high homology genes with the human genome. Furthermore, it is also a good model organism to study mitochondrial functions because of its special properties. Most of the discoveries about mitochondria were found on S. cerevisiae model organism. Most importantly, it is a facultative microorganism which can survive under mitochondrial dysfunction and it has several survival mechanisms against mitochondrial DNA mutations. Mitochondria is an organelle which has the main function of producing energy by oxidative phosphorylation. In addition to this function, it has also other responsibilities like thermogenesis, apoptosis, lipid and sterol synthesis and calcium storage. It is a double-membrane organelle and includes its own mitochondrial DNA (mtDNA) and ribosomes which are structuraly different than cytoplasmic ones. As its structure and functions, it is more likely to prokaryotic microorganism. Functional disorders of mitochondria might cause mitochondrial diseases which are observed in the most energy-requiring systems, mainly nervous and muscle system. Those disorders typically cause cardiovascular and neurodegenerative disorders, vision and hearing loss, diabetes, kidney and liver failures. Although many discoveries were made on the pathogenesis of mitochondrial disorders in the last two decades, there are still no effective treatments to cure those diseases. Most of the genetic and functional information about mitochondria was obtained by the studies with S. cerevisiae as the model organism. Today, most of the mitochondrial diseases caused by genetic mutations are researched on S. cerevisiae models by using recombinant DNA technologies and rational metabolic engineering techniques. However, such experimental design has some limitations, such as requiring detailed genetic background knowledge, rejection of recombination by the organism and obtaining unexpected phenotypic results. Because of these limitations, inverse metabolic engineering has been introduced as an alternative approach. In light of this information, in the present study, it was aimed to obtain antimycin-A resistant S. cerevisiae mutants by evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering strategy, and to complete physiological analyses that are the first steps to enlighten the molecular basis of this resistance. Antimycin-A is a mitochondrial complex III inhibitor which binds to bc1 complex and inhibits electron transfer. It is the analog of quinone and binds Qi site of the bc1 region (Quinone binding site) Binding of antimycin-A to this site blocks further electron transfer from Qo site and electron transfer to complex IV is stalls. As a result, cells cannot produce enough energy via mitochondrial oxidation and are obliged to find alternative metabolicpathways to survive. Additionally, antimycin-A cause increased Reactive Oxygen Species (ROS) generation by disrupting redox reactions on the mitochondria. Other than antimycin-A, there are various mitochondrial inhibitors such as atpenin, oligomycin, stigmatellin or cyanide which are widely used in research. While deciding the mitochondrial inhibitor among others, many factors were considered. Thus, considering the high affinity to bind mitochondrial complex III, the power of inhibition at low concentrations and safety of use, it was decided to use antimycin-A as the mitochondrial inhbitior in this study. In this study, antimycin-A resistant mutants were selected successfully from both reference strain and EMS-mutagenized reference strain population. As the selection method, gradually increasing stress level application protocol was used in succesive batch cultures under respirative conditions to make cells dependent on mitochondrial functioning. After 52 passages, antimycin-A concentration was increased to 6.6 nM and mutant individuals were randomly picked from the final populations. Twelve mutants were chosen from the reference strain selection and 15 mutants were chosen from the EMS-mutagenized reference strain population. After those mutants were screened at different antimycin-A concentrations, two mutants with the highest resistance levels were chosen. It was observed that mutant individuals obtained from the reference strain selection were resistant to 15 nM antimycin-A, while mutants obtained from the EMS-mutagenized reference strain population were resistant to 50 nM antimycin-A. This study, based on the literature information, is the first one where antimycin-A resistant S. cerevisiae mutants were obtained by evolutionary engineering strategy. To determine whether the gained antimycin-A resistance was permanent or not, genetic stability test was applied. Except for one mutant individual obtained from the reference strain selection, all resistant mutants tested were genetically stable. Additionally, antimycin-A resistant mutant population obtained from the reference strain selection might indicate possible mutagenic effects of antimycin-A. Within the frame of physiological characterization experiments, cross-resistance analyses results revealed that, antimycin-A resistant mutants were also cross-resistant to caffeine, propolis, coniferyl aldehyde and ethanol. Similarly, mutants resistant to these chemicals except for the ethanol-resistant mutant were also found to be cross-resistant to antimycin-A in a previous study. This implies some similar molecular stress resistance mechanisms between these mutants. Resistance to ethanol is also an expected result, because the selection procedure was applied by using ethanol as the sole carbon source. In this study, antimycin-A resistant S. cerevisiae mutants were obtained by evolutionary engineering strategy and the physiological characterization experiments were performed. For further studies, genomic and transcriptomic analyses could be performed to identify alternative pathways which by-pass the effects of the nonfunctional mitochondrial complex, and possible pharmaceutical targets could be identified.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    625499

    Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae

    Kafeine dirençli saccharomcyes cerevisiae'nin tersine metabolik mühendislik ile eldesi ve moleküler karakterizasyonu

    YUSUF SÜRMELİ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    876220

    Chronological lifespan analysis of stress-resistant yeasts

    Strese dirençli mayaların kronolojik yaşam sürelerinin analizi

    ASLI NUR AKAYDIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    878667

    Genomic analysis of freeze-thaw stress-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Donma-erime stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin genomik analizi

    ÇAĞLA GÜNEY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    389219

    Physiological analysis of cobalt-resistant Rhodobacter sphaeroides obtained by evolutionary engineering

    Evrimsel mühendislik yöntemi ile elde edilen kobalta dirençli Rhodobacter sphaeroides bakterisinin fizyolojik analizi

    GÜNEŞ ATAY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  5. Tez No

    770931

    Evolutionary engineering of rapamycin-resistant yeast

    Evrimsel mühendislikle rapamisine dirençli maya eldesi

    ÖMER ESEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

Geri Dön