Geri Dön

Bag-1 might act as a regulator on apoptosis/autophagy switch through direct binding to beclin 1

Bag-1 ve beclin 1'in doğrudan etkileşiminin apoptoz/otofaji kararındaki olası düzenleyici etkisinin araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 535479
  2. Yazar: MİRAY TÜRK
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 90

Özet

BAG (Bcl-2 ilişkili anthanogen) protein ailesi, mantarlar, bitkiler ve hayvanlar gibi pek çok organizma türü arasında korunmuş bir ailedir ve hücre bölünmesi, tümorogenez, apoptoz (programlanmış hücre ölümü) ve otofaji (hücrenin kendi materyallerini sindirmesi) gibi hücrelerin yaşamı için önemli olan pek çok olayda önemli görevler üstlenen, çok işlevli proteinlerden oluşur. BAG-1, BAG ailesinin çokça bilinen üyelerinden biridir ve anti-apoptotik olarak kabul edilmektedir. BAG-1'in izoformları olan BAG-1L (Large, büyük), BAG-1M (Medium, orta) ve BAG-1S (Small, küçük) transkripsiyon sonucu üretilen ortak bir mRNA'nın üzerindeki alternatif translasyon başlangıç noktaları sayesinde oluşur. Bu mRNA'ya bağlanan ribozomun başlangıç için kullandığı kodona göre farklı izoformlar üretilir. Bu sebeple bütün BAG-1 izoformları farklı bir N-ucu taşırken ortak bir C-ucuna sahiptirler. Izoformlar nükleer lokalizasyon sinyali taşıyıp taşımamalarına göre hücre içinde nükleus ve sitoplazma gibi farklı bölgelerde bulunabilirler ve bu sayede farklı hedef moleküllerle ilişki sağlarlar. Bu etkileşimler dolayısıyla BAG-1 pek çok yolakta görev almaktadır. BAG-1'in etki ettiği mekanizmalar hücresel gelişim, hücre sağkalımı ve kanser oluşumu için önemlidir ve yapılan pek çok araştırmada, çoğu kanser türünde BAG-1 ekspresyonunun artmış olduğu gözlemlenmiştir. Bu sebeple, BAG-1'in kanserde prognostik açıdan önemli olduğu ve BAG-1 ekspresyonunun bir belirteç olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Diğer yandan, apoptoz hücresel homeostaziyi korumayı sağlayan önemli mekanizmalardan biridir ve belirli uyaranlara yanıt olarak hücrede morfolojik değişiklikler oluşturur. Apoptoz mekanizması içsel veya dışsal uyarılara bağlı olarak gerçekleşebilir. Dışsal uyarı, Fas ligandı olarak bilinen molekülün, membranda bulunan ve Fas reseptörü olarak bilinen kendi özgül reseptörüne bağlanması ile başlar ve bunun sonucu olarak kaspaz-8 aktivasyonu ve mitokondriden sitokrom c salınımı gerçekleşir. İçsel uyarıda, apoptoza yol açan ve apoptozu engelleyen proteinlerin miktarlarında ve/veya birbirlerine karşı olan oranlarında gerçekleşen değişime bağlı olarak mitokondriyal membran geçirgenliği değişir ve bu sayede sitokrom c mitokondriden salınır. Salınan sitokrom c, apoptozom adı verilen ve sonrasında kaspaz-9'u aktive edecek olan yapıyı oluşturur. Aktif kaspaz-9, kaspaz-8'i aktifleştirir ve bu sayede birbirini aktifleştirerek apoptoza sebep olan yolak etkinleştirilmiş olur. Bu sayede hücre programlı olarak ortadan kaldırılır. BAG-1'in apoptozu önleyici bir protein olarak bilinmesinin sebeplerinden biri mitokondriden, apoptoza yol açan proteinlerin salınımını sağlayan Bcl-2 üzerine etki etmesidir. Bununla birlikte, BAG-1'in Bcl-2 seviyesini hem transkripsiyonel hem de translasyonel seviyede koruduğunu gösteren çalışmalar da BAG-1'in anti-apoptotik etkisini açıklamaktadır. Hücrelerin değişen çevre koşullarına uyum sağlamak ve stres durumunda homeostaziyi korumak için kullandığı yollardan biri, kendi kendini sindirme anlamına gelen otofajidir. Bu mekanizmada hedef moleküller bir vezikül içerisine alınarak lizozoma yönlendirilir ve lizozom içinde sindirilir. Metabolizmanın yaşlanma ve hücre ölümü gibi önemli olaylarda düzenleyici olarak görev alıyor olmasından dolayı, otofaji mekanizmasında ortaya çıkabilecek bir aksaklık ya da bozukluk kanser veya nörodejeneratif hastalıklar gibi pek çok hastalığa sebep olabilmektedir. Otofaji mekanizması temel olarak mikro-otofaji, makro-otofaji ve şaperon-ilişkili otofaji olarak gruplara ayrılabilmektedir. Makro-otofajiden literatürde pek çok yayında kısaca otofaji olarak bahsedilmektedir bu otofaji türü ortadan kaldırılacak olan materyalin bir otofagozom içine alınmasını ve bu yapının lizozoma yönlendirilerek içindeki materyallerin parçalanmasını içerir. Otofagozom yapısının oluşumunu kontrol eden pek çok akış-yukarı regülatör protein bulunmaktadır ve bu regülatörler Vps34, Vps15 ve Beclin 1'I içeren pro-otofagozomal kompleksin oluşumunu kontrol ederler. Mikro-otofaji, materyallerin basitçe vezikül içine alınmasını kapsar. Şaperon ilişkili otofaji ise bir otofagozom oluşumunu içermez, parçalanma için gerekli işaret peptit dizisini içeren proteinlerin şareronlar tarafından tanınması ve doğrudan lizozoma yönlendirilmesi şeklinde gerçekleşir. BAG protein ailesinin üyelerinden olan BAG-1 ve BAG-3 şaperon-bağımlı otofajide temel rol oynamaktadır. Bcl-2'nin etkileşim partneri olan Beclin 1 ve otofajiyle ilişkili bir protein grubu olan otofaji-ilişkili proteinler (autophagy-related proteins,ATG) memelilerdeki otofaji mekanizmasının yürütücü temel proteinleridir. Beclin 1 proteini Bcl-2 protein ailesinde ortak olarak bulunan BH3 domaini taşır ve bu domain Bcl-2 ve Beclin 1'in etkileşim kurabilmesini sağlar. Bu etkileşim noktası, apoptoz ve otofaji mekanizmaları için bir kontrol noktası olarak işlev görür. Bcl-2 ve Beclin 1'in etkileşimi uzun yıllardır merak edilen ve üzerine çokça çalışılan konulardan biridir. Meme kanserli hastalardan alınan doku örneklerinde pek çok meme kanseri hastasında Bcl-2 miktarının artmış olduğu ve aynı anda ya da bundan bağımsız olarak Beclin 1 miktarının azaldığı görülmüştür. Apoptoz mekanizması için temel rol oynayan Bcl-2 ile otofaji mekanizmasında temel rol oynayan Beclin 1 proteinlerinin miktarında gerçekleşen bu değişikliğin, kanserleşme sürecinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Ayrıca, bu iki proteinin birbirleri ile etkileşim halinde kalması ya da birbirinden ayrılması otofaji ve apoptoz kararı üzerine etki eden temel mekanizmalardan biridir. Bcl-2 ile Beclin 1'in bağlı kalması durumunda otofaji baskılanırken, bu bağlantının apoptoz mekanizması üzerinde bir baskılayıcı etkisinin bulunmadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, ayrılmaları durumunda serbest kalan Beclin 1, diğer hedef proteinlere bağlanarak otofaji mekanizmasını başlatabilmektedir. Bu ayrılma için Bcl-2 ya da Beclin 1'den birinin etkileşim yüzeyinde bulunan belirli amino asit rezidülerinden fosforlanması, başka proteinlerin yarışmalı olarak Bcl-2 ya da Beclin 1'den birine etkileşim yüzeyini kapatacak şekilde bağlanması ya da Beclin 1'in spesifik olarak parçalanması gibi mekanizmalar kullanılabilmektedir. Proteasomal degradasyon, apoptoz ve otofaji mekanizmalarının pek çok noktada birbirleri ile etkileşim kurduğu bilinmektedir ve BAG-1 ve Bcl-2 etikileşimi ile Bcl-2 ve Beclin 1 etkileşimlerinden literatürde sıkça bahsedilmektedi. Ancak, BAG-1 ve Beclin 1'in olası etkileşimini inceleyen bir çalışma yer almamaktadır. Bu sebeple, bu çalışmada, hücreyi sağkalım yoluna yönlendiren BAG-1'in otofaji mekanizması tercihindeki etkisinin olası BAG-1-Bcl-2-Beclin 1 kompeksi üzerinden araştırılması ve bu etkinin Beclin 1 ile olan muhtemel etkileşim dolayısıyla olup olmadığının insan meme kanserli hücre hatlarında incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, başlangıç olarak BAG-1-Bcl-2, Bcl-2-Beclin 1 ve BAG-1-Beclin 1 etkileşimleri PRISM Webserver aracılığı ile modellenmiş ve etkileşim yüzeyleri belirlenmiştir. Bu analizler ile, literatürde varlığı bilinen BAG-1-Bcl-2 ve Bcl-Beclin 1 etkileşimlerinin olası yapısal modellemesi yapılmış, BAG-1-Beclin 1 etkileşiminin ise varlığı incelenmiştir. Modelleme verilerine dayanarak, MCF-7 ve BT-474 hücre hatlarından elde edilen transfekte edilmemiş ve BAG-1 aşırı ifade edilmiş örneklerle immün-çöktürme çalışmaları yapılmış ve bu sayede BAG-1-Bcl-2 ve Bcl-2-Beclin 1 etkileşimleri doğrulanmıştır. BAG-1 ve Beclin 1 immün-çöktürme deneyleri sonucu birlikte gözlemlenmiş, bu sayede etkileşimi gösterilmiştir. Ancak, BAG-1 ve Beclin 1 immün-çöktürme sonucu birlikte gözlemlenmiş olsa da, bu etkileşimin Bcl-2 üzerinden olup olmadığı bilinmemektedir. Bu yüzden, Bcl-2'nin olmadığı koşullar altında BAG-1'in çöktürülmesi ve Beclin 1'in varlığının araştırılması, bu sayede bu etkileşimde Bcl-2'nin rolünün varlığının araştırılması amaçlanmıştır. Her iki hücre hattında da Bcl-2 ifadesi siRNA transfeksiyonu ile azaltılmış, BAG-1 çöktürülmüş ve Bcl-2'nin olmadığı koşullar altında da Beclin 1 miktarı incelenmiştir. BT-474 hücre hattında Bcl-2 siRNA ile transfekte edilen ve edilmeyen hücrelerden elde edilen örneklerle yapılan immünçöktürme deneylerinde Beclin 1 seviyesinde fark görülmezken MCF-7 hücrelerinden elde edilen sonuçlarda transfekte edilen hücre örneklerinde Beclin1 seviyesinin azaldığı görülmüştür. Bu datadan yola çıkarak, Bcl-2'nin bu etkileşimde etkisinin olduğu söylenebilmektedir. Diğer yandan, Bcl-2 ve Beclin 1'in etkileşim yüzeyinde bulunduğu literatürde gösterilen Bcl-2'nin S70 rezidüsü ile Beclin 1'in T119 rezidüsünün fosforilasyonunun kompleks üzerindeki etkisi yine immünçöktürme yöntemi ile gösterilmiştir. Diğer yandan, olası BAG-1-Bcl-2-Beclin 1 kompleksinin hücreiçi görevinin incelenmesi amacıyla, BAG-1 anlatımı arttırılmış veya azaltılmış MCF-7 ve BT-474 hücre hatlarında otofaji belirteçleri immünblotlama yöntemi ile incelenmiştir. Bu amaçla, BAG-1 eksresyonu arttırılmış ve azaltılmış insan meme kanseri hücre hatlarında Beclin 1'in ekspresyon seviyesi ve fosforilasyon düzeyi incelenmiştir. Bunlara ek olarak, apoptozdaki temel görevinden dolayı Bcl-2'nin ve Bcl-2'nin Beclin 1 ile olan interaksiyonunun gerçekleştiği bölgeden (Serin 70) fosforlanmış hali olan p-Bcl-2 (S70)'nin ve otofaji belirteci olarak kabul edilen LC3 ve p62 proteinlerinin ifade düzeyleri immünblotlama tekniği ile ölçülmüştür. Otofaji varlığının belirteci olarak kabul edilen LC3II/LC3I oranının, 24 saat boyunca BAG-1 susturulmuş MCF-7 ve BT-474 hücre hatlarında büyük oranda arttığı, bir diğer otofaji göstergesi olan p-Beclin 1 (T119) seviyesinin ise BAG-1 ifadesi arttırılmış hücrelerde arttığı gözlenmiştir. Özet olarak, BAG-1-Bcl-2-Beclin 1 kompleksinde BAG-1 ve Beclin 1'in muhtemel etkileşimi dolayısıyla, BAG-1'in hücre içindeki diğer görevlerine ek olarak otofaji regülasyonu üzerinde de etkisi olduğu düşünülmektedir. Ancak bunu doğrulamak ve mekanizmayı tam olarak açıklayabilmek için in vivo çalışmalar ve ileri in vitro yapısal analizler gerekmektedir.

Özet (Çeviri)

BAG (Bcl-2-associated anthanogene) protein family, which is conserved among a variety of organisms, such as yeasts, plants and animals consists of multifunctional proteins which achieve important roles in vital pathways, such as proliferation, apoptosis, autophagy and tumorigenesis. One of the well-known members of this family is BAG-1, which is accepted as anti-apoptotic. Due to the alternative translation initiation from a single mRNA, all BAG-1 isoforms, which are BAG-1L (Large), BAG-1M (Medium) and BAG-1S (Small) have a unique N-terminus and a common C-terminus. Depending on the existing domains, BAG-1 isoforms can be found in different subcellular locations, such as nucleus or cytoplasm and for this reason, they are able to interact with diverse target molecules. This diversion makes BAG-1 able to modulate several important cellular pathways. On the other hand, apoptosis is one of the crucial mechanism of the cell, which is in charge of modulating cellular homeostasis and upon certain stimuli, it induces morphological changes. Apoptosis might occur through intrinsic or extrinsic pathways. Extrinsic pathway includes the binding of Fas ligand to its certain receptor on the cell membrane, which is known as Fas receptor, and as a result, activation of caspase-8 and release of pro-apoptotic factors from mitochondria. During intrinsic pathway, due to a change in mitochondrial membrane permeability, depending on imbalance between pro- and anti-apoptotic proteins, cytochrome c is released in order to induce formation of apoptosome. Apoptosome then activates caspase-9 which will activate caspase-8 and following downstream proteins. One of the reasons why BAG-1 is accepted as anti-apoptotic is that it inhibits release of pro-apoptotic factors from mitochondria. Also, researchers demonstrated BAG-1's reducing role for Bcl-2 degradation. Other mechanism cells use in order to adapt to stress or environmental conditions and maintain homeostasis is autophagy, which actually means self-eating. Depending on its regulatory roles in metabolism, aging, cell death and other processes, imbalance in autophagy might lead to different diseases, like cancer and neurodegenerative disorders. Beclin 1 and autophagy-related proteins (ATGs) are major supervisors of autophagy process. Autophagy can mainly classified into three categories, including macro-autophagy, micro-autophagy and chaperone mediated autophagy. In most of the studies, term“autophagy”stands for macro-autophagy, which includes formation of autophagosomes and fusion of these autophagosomes with lysosomes. Due to its vital roles within the cell and its complexity, autophagy initiation is controlled by many upstream regulators and these regulators control formation of pre-autophagosomal complex, consisting of Vps34, Vps15 and Beclin 1. Beclin 1 contains a BH3 domain, which is common in Bcl-2 family proteins and this domain is responsible for the interaction with Bcl-2. Disruption of this interaction serves as a switch between apoptosis and autophagy. Proteasomal degradation, apoptosi and autophagy mechanisms interact at various levels. Although there are various studies indicating the interactions between BAG-1 and Bcl-2 or Bcl-2 and Beclin 1 but there is not any data in the literature reporting an interaction analysis between BAG-1 and Beclin 1. Here, we aimed to investigate the impact of BAG-1, which directs cell to cell survival in many cases, on autophagy through the BAG-1-Bcl-2-Beclin 1 interaction. Also, we intented to uncover whether effect of BAG-1 occurs through direct interaction with Beclin 1. For this purpose, as a beginning, BAG-1-Bcl-2, Bcl-2-Beclin 1 and BAG-1-Beclin 1 interations are predicted by PRISM Webserver and on the strength of interaction analyses, immunoprecipitation assays with samples gathered from untransfected and BAG-1 overexpressed MCF-7 and BT-474 cell were conducted using IgG beads, in order to confirm interaction of BAG-1 and Bcl-2, Bcl-2 and Beclin 1 and finally, to control probable interaction of BAG-1 and Beclin 1. BAG-1 and Beclin 1 are observed together in immunoprecipitates. Althogh BAG-1 and Beclin 1 are found together at precipitates, Bcl-2 might be the bridging factor between them. In order to find out this, we downregulated Bcl-2, then, pulled BAG-1 and searched for the presence of Beclin 1. As a result, we saw that although Bcl-2 was downregulated, BAG-1 and Beclin 1 are found together. Furthermore, we also investigated the effect of phosphorylation at S70 of Bcl-2 and T119 of Beclin 1, which are found at the interation surface of Bcl-2 and Beclin 1, on the status of the complex. Additionally, expression levels of Bcl-2 and Beclin 1 and autophagy markers phospho-Beclin 1 (T119), LC3 and p62 are investigated by immunoblotting upon altered BAG-1 expression. LC3II/LC3I ratio, which is a widely accepted determinant of autophagy existence, is increased sharply following BAG-1 downregulation for 24 hours both in MCF-7 and BT-474 cell lines. On the other side, phospho-Beclin 1 (T119) level are increased obviously upon BAG-1 overexpression. To conclude, BAG-1 and Beclin 1 might be direct interaction partners and for this reason, BAG-1 might have a role in autophagy regulation through Bcl-2-Beclin 1 switch and all these three mechanisms, which are responsible for the regulation of the cell, might be regulated by this mechanism. Although further studies are needed to understand accurately the role of BAG-1 in breast cancer, it can be assigned as a potential biomarker due to its spectacular roles in autophagy, apoptosis and cancer.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    712272

    Self-efficacy perceptions of high school teachers of English and students regarding their EFL competencies on EBA live classes

    İngilizce alan yeterlikleri ve EBA canlı dersleri bağlamında lise öğretmen ve öğrencilerinin öz yeterlik algıları

    DUYGU EFETÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Eğitim ve ÖğretimÇukurova Üniversitesi

    İngiliz Dili Eğitimi Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GÜLDEN TÜM

    PROF. DR. TURAN PAKER

  2. Tez No

    129384

    N/pi and N/sigma interactions of the amide linkage with its N-substituents: A quantum chemical study

    Amid bağının N atomuna bağlı gruplarla N/pi ve N/sigma etkileşimleri: Kuantum kimyasal bir çalışma

    ÖZLEM DEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2002

    Kimyaİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. S. ANDRZEJ CİEPLAK

  3. Tez No

    421242

    Understanding the interplay between anti-apoptotic BAG-1 and AKT in mTORC1-mediated autophagy in breast cancer cell lines

    mTORC1 aracılı otofajide anti-apoptotik BAG-1-AKT etkileşiminin meme kanseri hücre hatlarında araştırılması

    ILGIN IŞILTAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  4. Tez No

    439664

    Investigation of the autophagy and apoptosis relation through BAG-1, BcL-2 and Beclin 1

    Otofajı̇ ve apoptoz ı̇lı̇şkı̇sı̇nı̇n BAG-1, BcL-2 ve Beclin 1 üzerı̇nden ı̇ncelenmesı̇

    GİZEM ALKURT

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  5. Tez No

    439663

    Studying the role of an anti-apoptotic Bag-1 protein in healthy & tumor tissues in patients with breast carcinoma

    Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik Bag-1 proteinin rolünün çalışılması

    EMİNE ARZU BAŞKALE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

Geri Dön